Способ консервации малярийных паразитов

СОЮЗ СОВЕТСНИХ ВММЛ;%НЕЗИ 16 А 0 АНИЕ ИЭОБРЕТЕ 11 ,ь СИС серд- размера ГОСУДЮфСТВЕННИЙ КОМИТЕТ СССРГЮ ДЕЛАМ ИЗОИ%ТЕНИЙ И 0 ТНРЦТИЙОПИС, (71) Ордена Трудового Красного Зна"мени институт медицинской паразитопогии и тропической медициныим; Е.И. Марциновского(56) 1.Ъ 7 з.зоа й.1.МРатгапг у Иа 1 гег С,А. Ргезегчасдоп оГ 1 пггАетугпгосуГьс богаз оЕ ае 1 ага 1 ратаз 1 гез Ьу опе-згер апй гио-зСер соо 11 п 8 рга.ейцгез. фВо 11 МНО", 1977, 55, (2/3) . .309-3192. ЯсЬпеЫет И.Э., ЛоЬпзоп В.Ь.,ЗЬейпег А.М. Бптчча 1 айве апй геепЪоп ой апЬим 1 ата 1 гев 1 зСапсе ой ва 1 агьа 1 рагаз;ез Ы геровЫогу ап118 иЫ п 3.ггодеп (-196 С)"Арр 11 ей шсгоЬхо 1 о 8 у," 1968, 16, 1422-1423(54) (57) СПОСОБ КОНСЕРВАЦИИ МАПЯРфИЫХ ПАРАЗИТОВ, включающий заражениемцщей мялярийными плазмодиями, извлечение биологического материала, содержащего эритроцнтарные стадии малярийных паразитов, замораживание ихв парах жидкого азота, О т л и ч а -ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения способа и увеличения количестваконсервируемцх малярийных паразитов,в качестве биологическогоматериала,содержащего эритроцитарные. стадиималярийных паразитов использу 10 тэксплантаты печени, селезенкица и легких, измельченные до0,5-2 мм,1147316 1Изобретение относится к медицине и биологии. а именно к маляриологии и касается способов криогенной консервации малярийных паразитов.Известен способ криогенной консервации малярийных паразитов, заключающийся в том, что биологический материал сначала замораживают при -79 С ,в смеси 96 -го спирта и сухого льда в течение 30 ьщн, после чего погру О жают в пары жидкого азота или в жидкий азот (температура -170 и -196 С соответственно). Однако указанный двуступенчатый способ криогенной консервации требует постоянного наличия сухого льда и дополнительных затрат времени Я .Известен также способ, который заключается в одноступенчатой криогенной консервации эритроцитарных стадий 20 малярийных паразитов Р.ЬегяЬе, Инфицированную Р.Ьег 8 Ье мышь забивают с помощью шейной дислокации и стерильно берут кровь из сердца в 3,8 -ном растворе цитрата натрия. 25 Максимально от одной мыши можно получить 0,5-0,8 мл крови. Это дает воэможность заморозить 1"2 пробы биологического материала, так как криогенная консервация осуществляет- ЗО ся в объемах ие более 0,4-0,5 мл. Цитратную кровь центрифугируют при 1500 об/мин в течение 10 мин, надосадочную жидкость удаляют. К осадку добавляют равный объем криопротек-35 такта следующего состава. 3: глицерин 20, сорбитол 3 и хлористый натрий 0,65, смешивают, разливают по 0,4-0,5 мп в стерильные пластиковые (желательно) пробирки и помещают в пары жидкого азота. Все манипуляции проводят при комнатной температуре с соблюдением правил асептики 23. Недостатком способа является сложность получения достаточного ко личества биологического материала, необходимого для оценки его эффективности и биологических характеристик штамма на нужном количестве животных, так как размораживание одной о пробы биологического материала обеспечивает заражение лишь 1-2 мышей, Кроме того, желательно оценивать свойства материала, полученного от одного животного, в течение года и в более 5 отдаленные сроки хранения, Для этого требуется большое количество идентичных проб. Целью изобретения является упрощение способа и увеличение количества консервируемых малярийных паразитов, получаемых от одной мьппи,Цель достигается тем, что согласно способу консервации малярийныхпаразитов, включающему заражениемьппей малярийными плазмодиями, извлечение биологического материала,содержащего эритроцитарные стадии малярийных паразитов и замораживаниеих в парах жидкого азота, в качестве биологического материала, содержащего эритроцитные стадии малярийнопаразитов, используют эксплантаты печени, селезенки, сердца и легких,измельченных до размера 0,5-1 мм.Способ осуществляют следующим образом,Инфицированную Р.ЬегяЬе 1 мьппьзабивают с помощью шейной дислокации,извлекают внутренние органы, которыесодержат кровяные формы малярийныхпаразитов. Из органов готовят клеточную суспенэию с добавлением питательной среды. Полученный биологический материал центрифугируют прн1300-1500 об/мин в течение 7-10 мин,надосадочную жидкость удаляют, осадок ресуспендируют в равном объемекриопротектанта. Полученную взвесьразливают по 0,5 мл в пластиковыпробирки и погружают в пары жидкогоазота,П р и м е р 1. Зараженную малярийными паразитами (Р.Ьеу 8 Ьех) мьппь весом 15-20 г забивают с помощью шейной дислокации на 7-е сутки послезаражения с паразитемией около 90 .Брюшную поверхность обрабатываюто96 -ным спиртом. Стерильно вскрывают брппшую полость и извлекают печень, селезенку, легкие, сердце. Изпечени готовят клеточную суспенэию.Орган помещают в ступку и растирают,постепенно добавляя питательную среду в соотношении 1: 10, Клеточнуюсуспенэию центрифугируют при1500 об/мин 10 мин. Надосадочнуюжидкость удаляют, осадок ресуспендируют в равном объеме криопротектанта, содержащего, Х; глицерин 28,сорбито 3 и хлористый .натрий 0,65.Полученную суспенэию разливают встерильные пластиковые пробирки по0,5 мп и погружают в пары жидкогоазота. Все манипуляции проводят прикомнатной температуре с соблюдениемправил асептики. Из одного животногоСоставитель С.СветлышевРедактор Х,Недолуженко Техред С.йовжий Корректор А.Тяско Заказ 1422,4 Тираж 743 Подписное ВНИИПИ Росударственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, .Раушская наб д.4/5филиал ППП "Патент", г.ужгород, ул.Проектная,4 Э1473 можно получить до 30 мл суспензии, т.е. 60 проб для замораживания. Оценка качества сохранности материала проводится путем испытания его инфективности на белых мышах. Для этого биологический материал размораживают и внутрибрюшинно по О, 1 мл вводят белым мьдпам, после чего ежедневно делают мазки крови иэ хвостовой вейы и подсчитывают процент паразите мии.На 7-8 сутки у мышей развивается типичная малярийная инфекция с паразитемией 80-90.П р и м е р 2. Способ аналогичный, . однако для поготовления клеточной суспензии используют селезенку, легкие, сердце, которые тщательно иэ 16 4мельчают глазными ножницами на мелкие Фрагменты размером 05-1 мм внебольшом количестве питательнойсреды. Режим центриЬугирования1300 об/мин 10 мин. Таким образом, предлагаемый способ одноступенчатого консервирования эритроцитарных стадий малярийных паразитов (Р.Ьег 8 Ьед) позволяет получить от одного экспериментального, животного не 1-2 пробы биологического материала, а 60 проб, что повышает эффективность способа, упрощает его осуществление (так как изолирование органов проще, чем взятие крови из сердца).