Способ определения антигена

/00 Е ков методыМир", 197 е 1 пз оГ ЬнпЙ сюдЬоцса Аса,рототип). ФРСТВЕККЫЙ КОМИТЕТ СССР М ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЬПЪЮ ОПИСАНИЕ ИЗОБ к деток:КОму сВиДКткйьСТ(54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИГЕНАв биологической жидкости путем элект.рофоретического разделения исследуемой жидкости в колонке с гелем споследующим введением антисыворотки,инкубированием реакционной системыи учетом результатов по наличию полос преципитации, о т л и ч а ю -щ и й с я тем, что, с целью повышения точности определения, разделениеисследуемой жидкости проводят в наружном слое геля, затем в геле формируют канал и антисыворотку вводятв этот канал,вносят исследуемую биологическую жидкость, которую наслаивают на поверхность гелевой колонки по капилляру, прибор заполняют буферными растворами, подводят напряжение и проводят разделение исследуемой биологической жидкости.После проведения разделения, гель извлекают иэ разделительной камеры для проведения реакции иммунодиффузии. Для этого разгерметизируют конец капилляра и извлекают его. В сформированный канал вводят анти- сыворотку. Гель в вертикальном положении оставляют на 12-24 ч для осуществления иммунодиффуэии и затем/внутри геля выявляют четкие линии преципитации, соответствующие фрак.циям антигена.Для идентификации линий преципитации и более четкого их выявления гелевые колонки можно окрасить специфическими красителями.П р и м е р 2, Для ускорения реакции иммунодиффузии канал в. колонке полиакриламидного геля после проведения диск-электрофореза заполняют агаром с иммунной сывороткой, колонку помещают в буферный раствор для электрофореза, например трисглицериновый буфер рН 8,6, через который пропускают перпендикулярно гелевой колонке электрический ток силой до 60-90 мА, Время диффузии сокращается до 30 мин.Агар с иммунной сывороткой готовят следующим образом.Агар варят в .буферном растворе до получения прозрачной однородной массы, Применяют 1,57.-ный гель агара. В остуженный до 50 С агар до- о 40 тщательно перемешивают и заливаютканал. антисыворотку.П р и м е р. 3. Выявление локализации иммуноглобулинов сыворотки Путем гомогенизации ткани печени с последующим центрифугированием галогената получают фракцию растворимых мембранных белков ткани печени. Затем определяют их титр в рациальиой иммунодиффузии по Манчини.1146051 1Изобретение относится к .иммунологии и касается способа определенияантигена.Ивестен способ определения антигена в биологической жидкости с5помощью реакции преципитации в лунках Я .Известен также способ определенияантигена в биологической жидкостипутем электрофоретического разделения 10исследуемой жидкости в колонке сгелем с последующим введением антисыворотки в лунки по сторонам геля,инкубированием реакционной системыи учетом результатов по наличию полос преципитации 2 .Однако известные способы не обеспечивают высокой точности определения,, Целью изобретения является повышение точности определения.Эта цель достигается тем, что согласно способу определения антигенав биологической жидкости путем электрофоретического разделения исследуемой жидкости вколонке с гелем споследующим введением антисыворотки,инкубированием реакционной системыи учетом результатов по наличию полос преципитации, разделение иссле- З 0,дуемой жидкости проводят в наружномслое геля, затем в геле формируютканал и антисыворотку вводят вэтот канал.П р и м е р 1. Разделительныекамеры для диск-электрофореза35(стеклянные трубочки) герметизируютс нижнего конца, установив их вертикально в подставке для полимеризации.Затем берут стеклянный капилляр,на 10-20 мм длиннее разделительной бавляют 1-107- иммунной сыворотки,камеры, диаметром 1-2 мм, Герметиэируют один из концов капилляра, заитем его вводят внутрь разделительнои Вместо агарового гелядля заливкамеры герметизированным концомвверх, не доводя его до конца камеры на 5-10 мм. Капилляр и разделительная камера располагаются соосио.Капилляр укрепляют в этом положении,оставляя открытым отверстие разде- крови, специфичных к растворимым50лительиой камеры, через которое вве мембранным белкам клеток печени,ден капилляр.Разделительн 5 ю камеру заполняютрастворами сомономеров, из которыхполимеризуется акриламидный гель. 55После полимеризации геля разделительную камеру укрепляют в приборе длявертикального электрофореэа, в нееСоставитель Г.СмирноваРедактор О.Черниченко Техред Л,Микеш Корректор М.Леонтюк Заказ 1253/6 Тираж 722 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, ЖРаушская наб , д, 4/5филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 3 11 Для этого готовят 10 порций 17,-ного агарового геля и вносят в него выделенную фракцию белков в разведении 1: 100-1: 10, После полимеризацин геля в нем формируют лунки, диаметр которых равен диаметру канала в полиакриламидной гелевой колонке (пример 1), В каждую лунку вносят по 0,05 мл сыворотки крови обследуемых больных и инкубируют до момента окончания иммунодиффузии, при этом-еЪ титр фракции мембранных белков выбирают таким, чтобы в реакции радиальной иммунодиффузии диаметр кольца преципитата не превышал диаметр колонки полиакриламидного геля.Монтируют устройство для электрофореза в геле, разделяют образцы сывороток крови объемом по 0,05 мл и формируют канал в геле по примеру 1. После этого в канал гелевой колонки вносят фракцию растворимых мембранных белков в необходимом титре и ннкубируют колонки до по- явления полос преципитации.Гелевые колонки с зонами преципитации подвергают денситометрированию. При этом, по предлагаемому способу на денситомограмме зона локализации искомых иммуноглобулинов 46051 4характеризуется ьдногорбным пиком,основание которого идентично длинефракции искомого иммуноглобулина,а высота пика пропорциональна егоконцентрации. При определении антигена по известному способу с последующей денситометрией преципитата,характер кривой двугорбый, так какпрямой сканирующий луч света при 1 О денситометрии пересекает дугу нре,ципитации дважды, поэтому двугорбаякривая не отражает точной локализацииискомого антигена в геле и не характеризует его концентрацию.При сравнительной оценке точности предлагаемого и известного способов и на примере десяти образцов сывороток крови больных выявлено, чтопо предлагаемому способу точная локализация искомого белка определяется в десяти случаях, тогда как поизвестному способу точное определение локализации белка получено вшести, удовлетворительное в двух инеудовлетворительное в двух случаях.Использование предлагаемого способа позволяет повысить точность определения антигена, что в свою очередь позволяет повысить качестводиагностики заболеваний.