Способ определения антител к гликолипидам

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 4(5)С 01 И 33 4 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИК АВТОРСКОМУ СВИЛ:ТЕЛЬСТВУ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(71) Всесоюзный кардиологическийнаучный центр АМН СССР и Московскийнаучно-исследовательский институтвакцин и сывороток им. Н.И.Мечникова; А з 1 щр 1 е ргосейцге аког 1 аЬе 111 пдЮе 13.рИ, А шод 1 гу ой Ьщ 1 сЬ. -125 1 Апа 1.В 1 осЬеш., 1977, 77, 340340-3452. ЯЬгЬа К ИасапаЪе Т.,Ппгегаюа У. Ри 1 сюага Б - ЬдровошеЬшшцпое 1 есСгойе. Селеш. Ьегс., 1980,155-158. 801141 36 А(54)(57) 1. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ГЛИКОЛИПИДАМ Ве путем встраивания липидного антигена в мембрану липосом, включения маркера внутрьлипосомы, проведения реакции компле:ментзависимого лизиса с последую-"щим потенциометрическим определением по выходу маркера из лизированных липосоМ, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышенияточности способа, в качествемаркера используют анион фтора.Изобретение относится кмедицине,в частности к методам определенияантител к липидным антигенам.Иэвестен способ определения антител к гликолипидам Ве и лепиду А радиологическим методом 1) .Изнестен также способ определения липидных антигенов с помощью содержащих в качестве маркера ион тетрапентиламмоний (ТПА ), сенсибилизированных линосом и ТПА ионселективного электрода 2 .,Недостатки способа заключаются в том, что необходим специальный синтез маркера и наличие н биологических системах ионов ИВ 4 ,аналогичных маркеру.Целью изобретения является повышение точности способа.Указанная цель достигается тем, что согласнО способу определения антител к гликолипидам Ве путем встраивания липидного антигена в мембрану липосом, включения маркера внутрь липосомы, проведения реакции комплементзависимого лизиса с последующим потенциометрическим определением по выходу маркера излизированных липосом,в качестве маркера используют анион фтора.Способ осуществляют следующимобразом.Ве-вакцину готовили следующимобразом: культуру мутанита Ба 1 вопе 11 а ппп 1 зо 1 а В 595 с агара Хоттингера смывали физиологическим раствором, доводили до концентрации 109 м клеток н 1 мл по оптическому стандарту ГИСК им,Тарасевича, прогревали 2 ч при 56 С и хранили прио4 С не более 30 дн.Перед иммунизацией животных Ве-вакцину ресуспендиронали, разводили стерильным физиологическим раствором до 10 клеток в 1 млВводили вакцинный препарат внут" ривенно по следующей схеме:1 день 0,25 мл; 5 день 0,5 мл;9 день 1,0 мл; 14 день 1,0 мл. На 21 день брали, 40 мл крови, отделяли сыворотку центрифугированием:Перед постанонкой пробы гиперимунную сыворотку прогревали при 56 С 30 мин для инактивации комплеомента и разводили ее ЭФР 1:100.Гликолипиды Ве (Г 11-Ве) выделяютхлороформ-метанольной экстракциейиз мутанта Ба 1 щопе 11 а ппп 1 зо 1 аВ 595.Липиды А (ЛА) получают из ГЛ-Векислотным гидролизом. Для реакции конкурентного ингибирования ГЛ-Ве и ЛА переводят в нодо- растворимое состояние комплексированием с бычьим сывороточным альбумином (БСА) в присутствии триэтиламина.1 О три контроля: пробы без комплимента, без гипериммунной сыворотки и с сывороткой неиммунизированных кролио.ков, Пробы инкубировали при 20 Св течение 30 мин. Коцентрацию ионов фтора определяли в объеме 100 мкл.55 На пластинчатый Ад/АдС 1 электродсравнения помещали 100 мкл пробы 60 65 .регистрировали через 3 мин, Для оп(5 20 25 30 Титры кроличьих гиперимунных .и контрольных сывороток предварительно оценивают по результатам реакции пассивной гемагглютинации (РПГА). РПГА проводят с формалинизированными эритроцитами человека гр.О(1)Р(, .сенсибилизированными ГЛ-Ве,Компонент исследуемых сывороток инактивируют прогреванием в течение 25-30 мин при 55-56 С. В реакции использован комплект сыворотки морской свинки(180 СНр в 1 мл),Липосомы готовят, используя яичный лецитин (Лн), холестерин (Х),дицетилфосфат (ДФ) и ГЛ-Ве н молярном соотношении Лн:Х:ДО:ГЛ=.2:1,5:О, 2:0,05 (обоснование соотношенияпредставлено в У,УП условиях осуществления способа). Контрольныелипосомы получают без гликолипида.Раствор липидов и хлороформе, содержащий 15 мг Лн; 5,8 мг Х; 1,2 мг ДФи 1 мг ГЛ-Ве, высушивают на роторном вакуумном испарителе до образования липидной пленки. К высушеннойлипидной пленке добавляют 0,9-1,9 мл0,14-0,15 М ИаР 1 0,120-0,125 МО 4 рН 7 3-7 4 тщательновстряхивают до образования гомогенной суспензии и озвучивают 4-5 разпо 20-30 с с охлаждением до 4-6 С.Невключившийся фторид натрия удаляют в течение 50-60 мин диализом против забуференного физиологического раствора (ЗФР; 0,120-0,125 МИа НРО 4, 0,145-0,147 М ИаС 11 рН 7,37,1) при соотношении объемов 1:9001:1000. Процент удаления маркераконтролируют измерением содержанияионов фтора ионселективным электродом в диализируемом растворе,Определение титров Ве-антител в гипериммуной сыворотке кролика проводили следующим образом: в пять пробирок добавляли 100 мкл суспензии сенсибилизированных липосом, 4 мкл комплемента (титр 180 СНв 1 мл) и различное количество гиперимунной сыворотки (разведенной 1:100). Объем каждой пробы доводили до 200 мкл ЭФР. Кроме этого ставили и в вертикальном положении фотоселективный электрод (ЭР-У 1), Анализируемый раствор занимал пространство между мембраной селективного электро. -да и пластинкой электрода сравнения. Разность потенциалов определяли спомощью универсального иономераЭР, значение показаний электрода1141336 Составитель И.ЕмельяненкоТехред М. Пароцай КорректорС.Черни Редактор А.Шишкина Подписноекомитета СССРи открытийРаушская наб, д.4/5 Филиал ППП Патент, г.ужгород, ул.Проектная, 4 ределения разности потенциалов пос-. ле полного разрушения липосом к 100 мкл исходной суспенэии сенсибилизированных липосом добавляли 80 мкл эабуферного физраствора и . 20 мкл (1,25) тритон. 5П р и м е р 1.Кролика иммунизировали по стандартной методике много- кратно внутривенно Ве вакциной, полученной иэ мутана Яа 1 пюпе 11 а ппп 1- зоСа В 595, для определения иммуногенности четырех серий вакцинных препаратов. Титры Ве-антител в кроличьих сыворотках оценивали описанным потенциометрическим методом .в реакции иммунного комплементэави симого лизиса липосом. Титры антител к гликолипидам Ве для четырех серий вакцинных препаратов состави ли 1:200001 1:20000 у 1:20000 и 1:5000.П р и м е р 2, Иммунизацию кро лика и определение титров антител к Заказ 489/33 Тираж 897 ВНИИПИ Государственного по делам изобретений 113035, Москва, Ж, гликолипидам Ве для четырех серийвакцинных препаратов производилипо примеру 1. Титры антител составили 1:20000 1:20000 р 1 з 20000 и1:5000. Изобретение упрощает метод выявления антител к липидным антигенам за счет использования доступного маркера (БаГ) и Фторселективного электрода. Использованный в качестве маркера анион фтора практически отсутствует в биологических системах и не влияет на реакцию иммунного взаимодействия, так как степень тормозящего воздействия ионов в Формировании иммунных комплексов параллельна обычному липотропному ряду. Кроме того, потенциометрический липосомальный метод в 10 раз чувствительнее, чем известные технические решения,