Способ диагностики лептоспирозов

: ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ рознои культуры к исследу с последующим определени тоспирозных антител, отли что, с целью повышения точ тики и упрощения способа, сыворотке добавляют убить ные культуры, далее образов лекс смешивают с комплем резусположительные эритро имеющего 1-ю группу крови ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ АВТОРСКОМ,Ф СВИДЕТЕЛЬСТ(54) (57) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ЛЕПТОСПИРОЗОВ путем добавления лептоспимои сыворотке м титров лепчающийся тем, ности диагноск исследуемой е лептоспирозавшийся компнтом и вносят циты человека,0 15 20 30 35 40 45 50 55 Изобретение относится к медицине, в частности к диагностике инфекционных заболеваний и может быть использовано для диагностики лептоспироза.Известен способ диагностики лептоспироза путем добавления лептоспирозной культуры к исследуемой сыворотке с последующим определением титров лептоспирозных антител 1. Однако известный способ недостаточно точен, поскольку он обладает невысокой чувствительностью и сложен в исполнении, а также требует использования парных сывороток и наличия полного набора живых диагностических лептоспирозных культур.Цель изобретения - повышение точности диагностики и упрощение способа.Указанная цель достигается тем, что согласно способу диагностики лептоспирозов путем добавления лептоспирозной культуры к исследуемой сыворотке с последующим определецием титров лептоспирозцых антител,к исследуемой сыворотке добавляют убитые лептоспирозные культуры, далее образовавшийся комплекс смешивают с комплементом и вносят резусположительные эритроциты человека, имеющего 1-ю группу крови.Способ осуществляется следующим образом.У больного Д. с соответствующим эпиданамцезом и клинической картиной, подозрительной ца лептоспироз, берут кровь в первыс дци поступления в стационар и через1 О дней после первого забора крови. Сыворотки крови больного исследуют реакцией иммуцоадизивцой гемагглютицации РИАГА, которую ставят в микротитрациоццых панелях в объеме 0,1 мл.Ингредиенты реакции: 1) буфер желатиновероцалмединаловый (ЖВМБ), РН 7,5: 17,0 г МаС 1; 0,75 мединала; 1, 5 г веронала;1 мл смеси 0,03 м СаС 1., и 0,1 м МдС,; дистиллированная вода до 400 мл. Для работы этот маточный раствор разводят дистиллированной водой в соотношении 1:4 и на каждь 1 е 100 мл раствора добавляют 0,1 мл 10%-цой желатицы. ЖВМБ применяют для разведения сывороток, ацтигецов, комплемента и эритроцитов; 2) исследуемая сыворот. ка, прогретая при 56 С в течение 30 мин; . 3) комплемент - консервированная (серно- кислым натрием и борной кислотой) сыворотка морских свинок. Используют в разведении 1,50 в 1:75; 4) эритроциты человека 0(1) группы, резусположительцые, хранят в растворе Алсевера при 4 С до 45 дней; для реакции из них готовят 1,5%-цую взвесь;5) лептоспирозные диагностикумы применяют 2-х тинов: ацтигены для диагностики лептоспироза реакцией микроагглютинации ТУ-21-43-74, которые производятся Ставро.польской биофабрикой; используют в рабочем разведении 1:20 - 1:40; формалинизироаанные антигены, которые готовят по методи ке Стицнера (954), применяются в рабочем разведении 1:10 - 1:20.Техника реакции; двухкратные разведения сывороток, начиная с 1:40, вносят в микротитрационные панели, Затем в каждую лунку добавляют определенный лептоспирозный диагностикум в разведении 1:40. Панели встряхивают на вибраторе и помешают в термостат при ( -37 на 30 мин. После этого в каждую лунку добавляют 0,025 мл комплемента в разведении 1:75. Панель снова встря. хивают на вибраторе и инкубируют в термостате 30 мин. Затем во все лунки вносят по 0,025 мл 1,5%-ной - взвеси эритроцитов человека, После очередного встряхивания на вибраторе панель оставляют при комнатной температуре на 1 ч (до прохождения контролей). Положительной считают реакцию на 3 или 4 креста. В опыт включают контроли исследуемых сывороток, антигена и комплекмента. Гемагглютинации в контрольных лунках не наблюдалось.В первой сыворотке гемагглютинация с Ч 1 егобаевоггЬафае отмечалась до титра 1:320, во второй до 1;10240.При параллельном исследовании данных сывороток в реакции аплютинации (РА) в первой сыворотке лептоспирозцых антител не выявлено. Титр антител во второй сыворотке к, 1 стегоцаетоггйарае оказался равным 1:640.Многократное нарастание титра лептоспирозцых антител в совокупности с соответствующим эпиданамнезом и клинической картиной позволяет поставить больному Д. диагноз: лептоспироз, вызванный 1 1 стегойаегп оггй ар ае. Пример 1. У больного, подозрительного на лептоспироз, на 4-й день болезни иссле- дована сыворотка крови параллельно при помощи РА и РИАГА. В РА лептоспирозные антитела не выявлены, с помощью РИАГА определены антитела к лептоспирам Эс(егойаегпоггЬарае в титре 1:1280 и поставлен диагноз: лептоспироз. На девятые сутки больной при явлениях почечно-печецочной недостаточности умер. На вскрытии диагноз: лептоспироз подтвердился (характерные патологоанатомические изменения в органах; обнаружение лептоспир при микроскопии срезов внутренних органов).Пример 2. У больного С. на второй день болезни произведен бактериологический посев крови ца лептоспироз. С этого же дня больной стал получать антибиотикотерапию: пенициллин со стрептомицином. Сыворотка крови больного исследована на 5-й и 14-й дци болезни. РА не выявила лептоспирозных антител ни в первой, ни во второй сыворотке больного. С помощью РИАГА определены антитела к лептоспирам НеЬдогпас(з в первой сыворотке в титре 1:320, во второй - 1:1280. Диагноз был подтверж1123702 Составитель Г. Крюкова Техред И. Верес Корректор М.Леонтюк Тираж 687 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 1 3035, Москва, Ж - 35, Раушская наб., д. 4/5 Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4Редактор И. КасардаЗаказ 8036/8 ден результатом бактериологического посева крови.Пример 3. У больного М. подозрительного на лептоспироз, исследована сыворотка крови на 3-й и 12-й день болезни. В первой сыворотке лептоспирозные антитела с помощью РА не выявлены, в РИАГА их титр оказался равным 1:320.Это свидетельствует о более высокой точности диагностики способом РИАГА уже в первые дни заболевания. (Комплементсвязывающие антитела, определяемые РИАГА, появляются в крови на 2 - 4 день болезни, а агглютинины, выявляемые РА, - только на 6 - 7 день).Во второй сыворотке этого больного титр антител в РИАГА был равен 1:20480, в РА только 1:640. Чувствительность РИАГА в данном случае в 32 раза превосходит чувствительность РА. Причем РА выявила антитела к трем серогруппам лептоспир: 1 г 1 егоЬаегпоггЬар 1 ае (1:640), Небдогпайз (1:640), Сап 1 со 1 а (1:320) (перекрестные серологические реакции). РИАГА оказалась более специфичной и выявила антитела только к лептоспирам НеЬдогпад 18, что позволяет поставить точный диагноз.При исследовании сывороток 84 больных лептоспирозом людей диагноз подтвержден с помощью известной реакции агглотинации (РА) в 73 случаях (86,9 о/о), а с помощью предлагаемой реакции иммуноадгезивной гемагглютинации (РИАГА) во всех 84 случаях (100 о/о). При этом титры антител, выявляемые в РИАГА, были в 10 - 50 раз выше, чем в РА. Уровень вырабатываемых антител у больных лептоспирозом невысок в связи с ранним применением антибиотиков. Высокая чувствительность РИАГА позволяет выявлять небольшие количества антител и тем самым повышает точность диагностики (пример 2). Важное преимущество РИАГА состоит в способности выявлять ранние комплементсвязывающие антитела, что обеспечивает точность диагностики в первые дни болезни, когда агглютининов, выявляемых с помощью РА, в крови еще нет. Кроме того, обладая более высокой специфичностью, РИАГА позволяет поставить точный серогрупповой диагноз (пример 3).Наряду с этим, точность диагностики при использовании РИАГА повышается за счет 5 10 15 20 25 30 35 40 45 объективности учета результатов реакции. При применении РА учет субъективен, осуществляется путем микроскопии в темном поле. При этом возможна неправильная интерпретация результатов вследствие неспецифической агглютинации лептоспир. Тогда как учет РИАГА, осуществляемый визуально по феномену гемагглютинации, является простым и четким.Преимущества предлагаемого способа диагностики лептоспирозов: значительное упрощение диагностики заболевания благодаря применению убитых штаммов лептоспир, вследствие чего устраняются большие трудности, связанные с необходимостью поддержания и использования в диагностических лабораториях полного набора живых лептоспирозных культур. Упрощается также учет полученных результатов реакции, который проводится визуально, а не в темном поле зрения микроскопа, как при РА, когда возможна неправильная интерпретация результатов. Высокая чувствительность способа. РИАГА по своей чувствительности в 2 - 10 раз превосходит РА, считающуюся самой чувствительной реакцией для диагностики лептоспироза, Это было показано при исследовании сухих агглютинирующих лептоспирозных сывороток, нативных гипериммунных сывороток кроликов и сывороток больных людей. Высокая чувствительность РИАГА позволяет выявлять лептоспирозные антитела в более ранние сроки после начала заболевания по сравнению с РА и другими серологическими реакциями. Многократное увеличение объема производимых исследований в связи с устранением необходимости просматривать под микроскопом и оценивать результаты реакции каждого разведения сыворотки с каждым из 13-ти сероваров лептоспир. Появляется возможность одномоментно исследовать большое количество сывороток благодаря использованию микротитрационных панелей. Обеспечение безопасности работы персонала благодаря использованию убитого диагностикума вместо живых культур лептоспир. Это имеет большое значение, так как в соответствии с положением Министерства здравоохранения СССР лептоспироз включен во вторую группу инфекций, требующих особых мер предосторожностей при работе.