Способ окраски нервных клеток

СООЗ СОВЕТСКИХМЦМЛИР/ЮЕВНРЕСПУБЛИК О НИЕ ДТЕЛЬСТВУ И АВТОРСКО 2, М шайег 1.а ргоЕ 11 е Кеаеатс ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(72) О.В (71) ЛГУ ственный тельский тут (53) 616 (56) 1, В 321714 7113/28-1301.8203,84. Бюл. В 12,Зайцева и Т.Н.Крячковаим, А.А.Жданова и Государсоюзный научно-исследовахимико-аналитический инсти.8 (088.8) Авторское свидетельство ССС кл, С 01 Н 1/30, 1971,ЬЬа Р.С. Со 181 всапптщ о СоМадпдпа соЬа 1 С-Г 111 ей 1 п СЬе дпзесС СНВ. В гамп 1976, ч. 105, 563-566.(54) (57) СПОСОБ ОКРАСКИ НЕРВНЫХ КЛЕТФ, включающий инъекцию в нейроны1водного раствора соединения кобальта, последующую инкубацию и фиксацию, приготовление препарата и контрастирование красителем, о т л и -ч а ю щ и й с я тем, что, с цельюповышения качества окраски, инкубацию и фиксацию проводят одновременно в растворе, содержащем насыщенныйраствор а(,-нитрозо-/3-нафтола и альдегидный фиксатор прн рН 7,4-7,5,далее препараты дополнительно фиксируют в альдегидном фиксаторе, аконтрастирование проводят гемалауном1 1 ОИзобретение относится к медицине, в частности к области исследования нервной системы.Известен способ окраски нервных клеток путем суправитальной окраски метиленовым синим с последующей докраской азотнокислым серебром ь 11.Недостатком способа является невысокое качество окраски тела нервной клетки.Наиболее близким по технической сущности является способ окраски нервных клеток, включающий инъекцию в нейроны водного раствора соединений кобальта, последующую инкубацию и фиксацию, приготовление препарата и контрастирование красителя 12.Недостатком способа является неустойчивость окраски нервных клеток вследствие появления при инкубации серо-бурого фона от сульфида аммонияЦель изобретения - повышение качества окраски нервных клеток.Указанная цель достигается согласно способу окраски нервных клеток, включающему инъекцию в нейроны водно-. го раствора соединения кобальта, последующую инкубацию и фиксацию, приготовление препарата и контрастирование красителем, при котором инкубацию и фиксацию проводят одновременно в растворе, содержащем насыщенный раствор о-нитрозо-/5-нафтола и альдегидный фиксатор прирН 7,4-7,5, далее препараты дополнительно фиксируют в альдегидном фиксаторе, а контрастирование проводят гемалауном.Способ осуществляют следующим образом".В эксперименте изолируют центральную нервную систему, например, моллюска Ьушпаса айат па 1 де. Выби" рают нервные клетки, в которые инъекцируют водньй раствор хлористого кобальта путем его пассивной диффузии через перерезанные периферические отростки нервной клетки.Далее нервные клетки щУомывают в двух сменах физиологического раствора.Фиксацию и инкубацию осуществляют в растворе, содержащем насыщенныйД раствор оь-нитрозонафтола и альдегидный фиксатор при рН 7,4-7,5, затем препараты дополнительно фиксируют в глютаровом альдегиде и пара- .форме, промывают в фосфатном буфере и докрашивают гемалауном, приготав 83095 зливают срезы, которые заключают вдаммарову смолу,П р и м е р 1. В нервные клеткиизолированной центральной нервнойсистемы моллюска (Ьушп аса зеа 811 э)размером 1,5-3 мм, вводят водныйраствор хлористого кобальта. Введение проводят при 14 С в течениео1 сут.10 Промывку осуществляют в двух сменах физиологического раствора, вкаждой по 2 мин.Промытые препараты помещают в ин.кубационный раствор, состоящий изо-нитрозо-нафтола на буфернойсмеси, .содержащей 0,47. параформ и1,07 раствор глютарового альдегидапри рН 7,4. Температура фиксации ЗОСИнкубационный раствор готовятследующим образом.Раствор А. В 40 мл подогретойдистиллированной воды растворяется400 мг параформа.Раствор Б. К раствору А добавляетд ся 200 мг а(;нитрозо-ф-нафтола. Раствор подогревается при постоянномпомешивании до полного растворенияс-,нитрозо-ф-нафтола.Раствор В. Раствор Б доливаетсядо 95 мл фосфатным буфером с рН 7,5.Раствор Г. К раствору В добавляется 5 мл 253 глютаральдегида, и фильтруется через вату.Время инкубации зависит от разме 35 фра.препарата, критерием оценки.служит появление ярко-алой окраски нейронов. Для нейронов размером 1,5-3,0время инкубации составляет 10-15 минДалее препараты переносят в Фиксатор,состоящий из 0,53 раствора параформаи 1,03 раствора глютарового альдегида при рН 7,4, на 4 ч. Промывку пре-,парата проводят в фосфатном буферетого же рН в течение 1 ч.Промытые препараты помещают на12-24 ч в 203-ный раствор сахарозынафосфатном буфере с рН 7,4, приготавливают замороженные срезы, которысдокрашивают гемалауном, обезвоживаютв возрастающих концентрациях изобутилового спирта и заключают в даммаровую смолу,П р и м е р 2. Готовят препаратынервных клеток изолированной центральной нервной системы, размером55 4,0-7,0 мм (моллюска Н е 11 з чц 1 яагз Ь). Введение хлористого кобальтаосуществляют при 14 С в течениеог сут.15 Составитель Л.СтебаеваТехред Т.фанта Редактор С.Юско Корректор М.Шароши Заказ 1734/38 Тираж 823 Подписное ВИИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, улПроектная, 4 3 1Промывку осуществляют в трех сменах физиологического раствора, в каждой по 3 мин.Промытые препараты помещают в инкубационный раствор, как в примере 1, Время инкубацни составляет 15- 20 мин, Дофиксацию проводят в буферных растворах альдегидов в течение 10 ч.Последующую промывку осуществляют в течение 3 ч.Отмытые от фиксирующей смеси препараты быстро обезвоживают в возрас-. тающих концентрациях изобутилового спирта. Затем переносят в две смены смеси (1: 1) 99,5 й-ного изобутило. вого спирта и хлороформа, а 5 мин в каждой помещают на 10 мин в хлороформ и затем на 3 ч смесь хлоро 083095 4форма с парафином при 37 ОС (1:1).Потом из препаратов приготавливаютсрезы, которые подкрашивают гемалауном по стандартной прописи.5 Для получения целлоиДиновых срезов отмытые от фиксирующей жидкостипрепараты проводят по стандартному.методу.Применение предлагаемого способа 1 О повышает качество окраски нервныхклеток вследствие улучшения дифференцировки клеток от окружающих ткан.,"1,а также повышения стойкости,окрашивания. Способ нашел применение при исследовании принципов формированиярефлекторных актов нервной системыи вопросов адаптивного поведения,