Способ фиксации исследуемых нервных клеток на тестирующем электроде и устройство для его осуществления

Союз Советских Социалистических РеспубликОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ о 1773485(22) Заявлено 0204.79 (21) 2743832/28-13с присоединением заявки Мо(23).ПриоритетОпубликовано 231080 Бюллетень Мо 39Дата опубликования описания 231080 Кз С 01 и 27/26 Государственный комитет СССР по делам изобретений и открытий(72) Автор изобретения А.И,Сызганов Горьковский государственный медицинский институт им. С. М, Кирова(54) СПОСОБ ФИКСАЦИИ ИССЛЕДУЕМЫХ НЕРВНЫХ КЛЕТОК НА ТЕСТИРУЮЩЕМ ЭЛЕКТРОДЕ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯИзобретение относится к медицине и предназначено для изучения влияния растворов различных веществ на электрическую активность нервных клеток.Известен способ Фиксации исследуе мых нервных клеток на тестирующем электроде. Способ осуществляют устройством, содержащим камеру с тестирующим и индифферетным электродами 111. 10Недостатком данного способа является то, что ограниченное время и ненадежность закрепления нервной клетки на микроэлектроде (расположенное в жидкости тело клетки легко смещается относительно кончика тестирующего микроэлектрода) не позволяют следить за динамикой электрической активности клетки в данном растворе и исследовать влияние нескольких раз личных растворов с известной концентрацией на одну и ту же клетку.Цель изобретения - обеспечение продолжительной и надежной Фиксации исследуемой нервной клетки на тести рующем электроде при заполнении или смене клеточной культуры или воздействующих веществ.Укаэанная цель достигается тем, что на тестирующий и индифйерентный 2электроды подают напряжение постоянного тока, причем на тестирующий электрод подают положительный потенциал, а на индифферентный электрод отрицательный потенциал напряжения постоянного тока.Данный способ может быть осуществлен устройством содержащим камеру с тестирующим и индифферентным электродами, в который введены последовательно соединенные источник напряжения постоянного тока, коммутатор полярности и переключатель, причем тестирующий электрод соединен с переключателем, а индифферентный электрод соединен с коммутатором полярности.На чертеже изображена схема устройства для осуществления способа фиксации исследуемых нервных клеток на тестирующем электроде.Устройство содержит микроэлектрофоретическую камеру 1 (высотой 2 мм, шириной 10 мм и длиной 15 мм) в длинных стенках которой вмонтированы тестирующий микрозлектрод 2 и индифферентный электрод 3. В противоположных коротких стенках камеры выполнены впускное и выпускное отверстия 4, которые служат для пропускания жидкости через камеру. Тестирующий микроэлектрод 2 и индифферентный электрод 3 через переключатель 5 и источник 6 напряжения постоянного тока подключены в микроэлектрофоретическую цепь. Для изменения полярности электродов в микроэлектрофоретическую цепь введен коммутатор полярности.Способ осуществляется слецующим образом.Раствор хлористого натрия (0,9 н.) с клетками переживающей культуры нервной ткани помещают в герметичную микроэлектрофоретическую камеру. Затем через систему "тестирующий микро- электрод - раствор с клетками пере живающей культуры нервной ткани второй электродп пропускают электрический ток от внешнего источника ЭДС.В результате к положительно заряженному тестирующему микроэлектроду из Щ раствора притягивается и Фиксируется нагруженная отрицательным электрокинетическим (дзета-) потенциалом одна из клеток переживающей культуры нервной ткани. Остальные клетки переживающей культуры удаляют из микроэлектрофоретической камеры путем пропускания через камеру чистого раствора хлористого натрия (0,9 н.). Микроэлектрофорез прекращают. Затем проводят регистрацию электрической активности клетки, закрепленной на кончике тестирующего микроэлектрода за счет возникающих в результате микрозлектрофореза сил поверхностного натяжения и межмолекулярного сцепления.В дальнейшем Физиологический раствор (0,9 н. йаС 1)в микроэлектрофоретической камере заменяют на раствор химического или фармацевтичес кого вещества с. известной концентрацией путем пропускания через камеру раствора с известной концентрациейвоздействующего химического или Фармацевтического вещества. Проводятповторную регистрацию электрическойактивности закрепленной ранее на тестирующем микроэлектроде той же самой клетки.П р и м е р. Взвесь клеток свежеприготовленной переживающей культурыкорковой ткани мозга кошки в физиологическом растворе с температурой37 С помещают в герметичную микроэлектрофоретическую камеру (в 1 ммраствора содержится около 10 клеток),Затем через систему "тестирующий микрозлектрод в .раствор с клетками - второй электрод" пропускают электрический ток от внешнего источника постоянного напряжения с ЭДС 20 В в течение 603 мнн, В результатемикрозлектрофорезак положительно заряженному тестирующему микроэлектроду из раствора притягиваетсн и Фиксируется за счет сил поверхностного натнжения и межмолеку лярного сцепления одна из клеток переживающей культуры нервной ткани,нагруженная отрицательным электрокинематическим (дзета-) потенциалом.В момент контакта нервной клетки скончиком тестирующего микроэлектрода процесс злектрофореза прекращается. Об окончании процесса электрофореэа свидетельствует уменьшениепротекающего через систему тока скачком от 15 мкА др неощутимо малойвеличины.Остальные (незафиксированные)клетки переживающей культуры удаляютиз камеры путем пропускания через неефизиологического раствора.На усилителе биопотенциалов(УПТ) регистрируют пиковые потенциалы клетки а.1 плитудой 25 - 30 мВ.Затем Физиологический раствор вэлектрофоретической камере заменяютна раствор рингера с 0,1% содержанием сернокислого магния и проводятповторную регистрацию электрическойактивности закрепленной ранее натестирующем микроэлектроде той жесамой клетки. По разнице картин электрической активности одной и той жеклетки, зарегистрированной до ипосле воздействия на клетку раствором химического и Фармацевтическоговещества (например, по сдвигу уровня постоянного потенциала или подинамике спектральной плотностигенерируемых клеткой пиковых потенциалов), изучают эффективность влияния действующего раствора химического или Фармацевтического веществас известной его концентрацией наданную клетку.устройство работает следующимобразом,После заполнения микроэлектроФоретической камеры 1 растворомхлористого натрия с клетками переживающей культуры нервной тканипереключатель 5 ставят в левое положение, при этом на тестирующий микроэлектрод 2 от источника 6 напряжения через коммуматор полярности 7,находящиися в верхнем положении,подается положительный полюс, а наиндифферентный микроэлектрод 3отрицательный полюс источника 6напряжения,Вследствие тбго, что нервные клетки переживающей культуры мозговойткани обладают отрицательным электрокинетическим (дзета-) потенциалом,они притягиваются из раствора хлористого натрия к кончику тестирующе"го микроэлектрода 2, обладающейу поположительным потенциалом. Микроэлектрофорез прекращается, когдаодна из нервных клеток окажетсязафиксированной на кончике тестирующего микроэлектрода 2. Микроэлектрофорез прекращается вследствие того,что сопротивление мембраны нервной773485 Формула изобретения Составитель В, ОстапчукРедактор О. Колесникова Техред Н.Бабурка Корректор Л, Иван Заказ 749255 Тираж 1019 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5Филиал ППП "Патент",г. Ужгород, ул. Проектная, 4 клетки постоянному току достаточно велико (более 100 МОм), Нервная клетка удерживается на кончике тестирующего мИкроэлектрода 2 за счет сил поверхностного натяжения и межмолекулярного сцепления.Затем через микроэлектрофоретическую камеру 1 пропускают чистый 0,9 н.раствор хлористого натрия, удаляя таким образом остальные клетки. Переключатель 5 ставят в правое положение и с помощью электронных усилителей (на чертеже не показанй) изучают электрическую активность нервной клетки, покоящейся у кончика тестирующего микроэлектрода 2 в растворе хлористого натрия. 15Для изучения активности этой же нервной клетки в другом растворе (например, в растворе Рингера) из камеры 1 удаляют раствор хлористого натрия и в то время, когда нервная 20 клетка зафиксирована к кончику положительно заряженного тестирующего микроэлектрода 2, заполняют камеру раствором Рингера. В дальнейшем процесс изучения электрической активности клетки повторяютТаким образом, данный способ обеспечивает проведение в широком диапазоне исследования влияния на клетку одного раствора в динамике (в зависимости от времени или концентрации), а также изучение эффективности действия различных растворов на одну и ту же клетку. 1. Способ фиксации исследуемых нервных клеток на тестирующем электроде, отличающийся тем, что, с целью продолжительной и надежной фиксации исследуемой нервной клетки на тестирующем электроде при заполнении или смене клеточной культуры или воздействующих веществ, на тестирующий и индиФферентный электроды подают напряжение постоянного тока, причем на тестирующий электрод подают положительный потев" циал, а на индифФерентный электрод отрицательный потенциал напряжения постоянного тока. 2. Устройство для осуществленияспособа по п.1, содержащее камерус тестирующим и индифферентнымэлектродами, о т л и ч а ю щ е ес я тем, что, в него введены последовательно соединенные источникнапряжения постоянного тока, коммутатор полярности и переключатель,причем тестирующий электрод соединенс переключателем, а индифферентныйэлектрод соединен с коммутаторомполярности,Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1, Мещеряков К.С. Об энергетикебиологических процессов. М., "Наука",1967, с, 89-108.