Способ определения жизнеспособности яиц гельминтов

ЯО 10824 СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИН ц А 61 В 10/О ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Ъ ьньт " 2. Способчто в качествили фуксин. п. 1, отличаю асителя бер иися тем, сафранин ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(71) Ордена Трудового Красного Знамени институт медицинской паразитологии и тропической медицины им. Е. И, Марциновского(56) 1. Авторское свидетельство СССР550156, кл. А 61 В 10/00, 1975,2, Дроздов В, Н. Выживаемость яиц Ор ЫЬогс)из 1 е 11 пецз (К 1 чо 11 а, 1884) в различных условиях внешней среды.-Медицинская паразитология и паразитарные болезни. М., Медгиз.,3, 1962, с. 323-326. (54) (57) 1. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ ЯИЦ ГЕЛЬМИНТОВ, заключающийся в прокрашивании их в водной среде красителем с последующим микроскопированием и подсчитыванием, отличающийся тем, что, с целью повышения точности определения, яйца гельминтов предварительно охлаждают до 4 - 6 С, подсушивают, после чего заливают средой, содержащей 96%-ный этанол, краситель и 0,05 трис-НС буфер в соотношении (9 - 12): : (1 - 10): (78 - 90) при рН 8,5 - 9,5, далее нанесенные на предметное стекло яйца гельминтов в той же среде перед микроскопированием покачивают и жизнеспособность определяют по числу вышедших мирацидиев,55 Изобретение относится к медицине, в частности к паразитологии.Известен способ определения жизнеспособности личинок гельминтов, заключающийся в том, что при определении жизнеспособности адолес кар иев п ар амфистоматид последние помешают в 0,4 - 0,6/О-ный раствор сернистого натрия, приготовленного на 0,5 - 0,850/О-ном растворе МаС 1, и жизнеспособными считают адолескариев, из которых эксцистировались личинки парамфистоматид.Известный способ не позволяет определять жизнеспособность яиц трематод.Наиболее близким к предлагаемому является способ определения жизнеспособности яиц гельминтов, основанный на замещении красителей и заключающийся в том, что яйца гельминта вначале подвергают окрашиванию бриллианткрезилблау, а затем сафранином. При этом происходит замещение красителей и живые яйца приобретают 20 красную окраску, а неживые становятся двухцветными: скорлупки красные, содержимое яйца-синее 2,Недостатком данного способа является низкя точность идентификации жизнеспособных яиц, так как определение проводится косвенным методом на основании плохо выраженных различий в окраске живых и погибших яиц, к тому же эта разница в окрашивании исчезает через 30 - 40 мин:Цель изобретения - повышение точности определения.Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения жизнеспособности яиц гельминтов, заключающемся в прокрашивании их в водной среде красителем с последующим микроскопированием 35 и подсчитыванием, яйца гельминтов предварительно охлаждают до 4 - 6 С, подсушивают, после чего заливают средой, содержащей 960/О-ный этанол, краситель и 0,05 трис-НС 1 буфер в соотношении (9-12); 40 : (1 - 10): (78 - 90) при рН 8,5 - 9,5, далее нанесенные на предметное стекло яйца гельминтов в той же среде перед микроскопированием покачивают и жизнеспособность определяют по числу вышедших мирацидиев.45При этом в качестве красителя берут сафранин или фуксин.Способ осуществляют следующим образом, Предварительно охлажденные до 4 - 6 С и слегка подсушенные с помощью полоски фильтровальной бумаги яйца тре матод (описторхисов, клонорхисов) заливают в центрифужной пробирке средой комнатной температуры, содержащей, ч.:960/О-ный этанол 9-12Краситель (маточныйраствор) 1 - 100,05 у трис-НС 1 буфер(рН 8,5 - 9,5) 78 - 90 Пробирку слегка встряхивают, затем 0,1 мл (1 - 2 капли) среды со взвешенными яйцами переносят на предметное стекло и оставляют на 5 - 10 мин. Предметное стекло с каплей при этом необходимо слегка покачивать для создания слабых токов жидкости, Затем добавляют еще 0, мл среды и осторожно накрывают нокровным стеклом, Препарат просматривают под обычным световым микроскопом при 20-кратном увеличении. Жизнеспособность определяют по числу вышедших из яиц мирацидиев.Пример 1. Среду готовят из 9 ч. 96%-ного этанола, 1 ч насыщенного спиртового раствора фуксина, остальное (до 100 ч) 0,05 Р трис-НО буфер, рН 9,5.Определение жизнеспособности яиц, Взвесь яиц в воде предварительно охлаждают в холодильнике до + 4 С. В центрифужную пробирку пипеткой вносят 1 каплю взвеси, содержащей 100 - 500 яиц (меньшее их число может дать нерепрезентативные результаты, а большее затрудня т подсчет). Пробирку со взвесью яиц ставят в штатив на 3 - 5 мин для того, чтобы яйца опустились на дно. Полоской фильтровальной бумаги, опущенной в пробирку, осторожно отсасывают излишки воды и пастеровской пипеткой в пробирку с подсушенными таким образом яйцами добавляют 0,1 мл среды,встряхивают, пипеткой переносят на предметное стекло и оставляют на 10 мин, слегка покачивая. Затем добавляют еше 0,1 мл среды и осторожно накрывают покровным стеклом.Препарат просматривают под обычным световым микроскопом при 20-кратном увеличении. Перечисленные операции занимают 20 - 25 мин, вместе с подсчетом вышедших мирацидиев 30 - 40 мин.Пример 2. Среду готовят из 12 ч 960/Оного этанола, 10 ч маточного раствора сафранина (5 мг в 10 мл дистиллированной воды), остальное (до 100 ч) 0,05 /ц трис-НС буфер, рН 9,5,Определение жизнеспособности яиц проводят как в примере 1, но взвесь яиц в воде предварительно охлаждают до + 6 С.Пример 3. Среду готовят из 11 ч 960/О- ного этанола, 5 ч маточного раствора сафранина (5 мг в 10 мл дистиллированной воды), остальное ( до 100 ч.) 0,05,4 трис- -НС буфер, рН 9,0,Определение жизнеспособности проводят как в примерах 1 и 2, но взвесь яиц в воде предварительно охлаждают до + 5 С.Испытание метода проводили на яйцах описторхисов (ОрЫЬогсЬз е 11 пецз) и клонорхисов (СопогсЫз з 1 пепз 1 з), полученных из гельминтов при вскрытии спонтанно инвазированных кошек из очагов описторхоза (в Томской и Сумской областях) и клонорхоза (Хабаровский край) и экспериментально зараженных лабораторных жи1082402 52,0-+21,3 75,0+12,0 10-20 дней19 мес. 75,0+1,2 12,8+0,7 Составитель В. Фролова Редактор А.Мотыль Техред И. Верес Корректор О. Билак Заказ 1603/3 Тираж 688 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и от крытий 113035, Москва, Ж - 35, Раушская наб д. 4/5 Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4вотных (золотистых хомяков). Полученные таким образом яйца гельминтов в различное время (от нескольких часов до двух лет) и при различной температуре (от 0 до 25 С) содержались в воде.Предлагаемый способ определения жизнеспособности яиц гельминтов (трем атод, у которых выход личинок из яиц в естественных условиях происходит в организме промежуточного хозяина - пресноводного моллюска) основан на физико-химической активации железы вылупления мирацидия и стимулирования его двигательной активности, что приводит к активному выходу мирацидиев из яиц в экспериментальных условиях.Выход мирацидиев осуществляется при действии на яйца гельминтов среды в сочетании с рядом обязательных последовательных приемов: созданием перепада температур, подсушиванием взвеси яиц, созданием слабого тока жидкости в исследуемой капле. Основная функция среды - химическая активация железы вылупления мирацидиев. Все составные части среды подобраны экспериментально, изменение их соотношений сверх данных пределов ведет крезкому снижению выхода личинок. Добавляемый в среду краситель не несет основной функции в определении жизнеспособности яиц, а лишь облегчает нахождение и подсчет вышедших мирацидиев, поэтому можно использовать любой краситель, работающий в пределах рН 8,5 - 9,5, в частности взят.сафранин и фуксин.Предварительное охлаждение взвеси яиц до 4 - 6 С (как и другие указанные физические воздействия) дополнительно стимулирует активность железы вылупления мирацидия. Охлаждение яиц до температуры ниже +4 С вызывает длительное торможение активности железы вылупления, что ведет к прекращению выхода личинок.В таблице приведены результаты определения жизнеспособности яиц описторхисов, определенные известным и предлагаемым способами,Более высокая точность определения попредлагаемому способу подтверждается 20 резким снижением статистической ошибкиполучаемых результатов. Кроме того, процент жизнеспособных яиц после 9 мес.хранения, определенный предлагаемым способом, соответствует норме, в то время как определенный известным способом оказывается резко завышенным вследствие прокрашивания пустых скорлупок как живых объектов.