Способ получения суспензии клеток

ОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕН ИяК ПАТЕНТУ о 1753346 Союз Советских Социалистических Республиклено 04.07,78 (21) 2639945/28-1 32) 21.07.7733) США Прио Государственный комитет:616.155 (088.8) крыти 72) Автор изобретения остр анеан КимСША) Заявит Иностранная фирма Текникон Иструментс КорпорейшнЕНЗИИ КЛЕТОК зо Первоначально антикоагулированно гентом. Он действу варительно меняющ бы при добавлен повредить морфол клеток или тромбоц вание красных кров(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ Изобретение относится к области медицины, а именно к гематологии.Известен способ, получения суспензии клеток путем обработки крови формальдегидом и добавления гемолизирующего агента Ц.Однако известный способдифференцировать тромбоцитов и эр итр оцитов.Целью изобретения является обеспечение возможности дифференциации тромбоцитов от лейкоцитов и эритроцитов.Эта цель достигается тем, что перед введением формальдегида кровь обрабатывают детергентом, таким как полиоксиэтилен 20 сорбитан монолаурат концентрации от 0,3 до 2,0 по отношению к:меси, при рН от 6 до 8 с последующим инкубированием смеси при температуре от 55 С до 62 С в течение двух минут.Способ осуществляют следующим обрапроизводят обработку го образца кловидетерет как вещество, пред- ее среду для того, чтсных концентрациях не огню белых, кровяных итов, а также лизирояных клеток. Детергентом предпочтительно является полиоксиэтилен 20 сорбитан монолаурат, но могут быть применены и другие детергентные материалы, такие как полиоксиэтилен 23 монолауриловый простой эфир и полиоксиэгилен 20 сорбитан мсноолеат. способные предварительно изменять средч красных кровяных клеток без их лпзировани я.Концентрация детергента в смеси может быть от 0,03 до 2,0 , предпочтительно 0,4 - 0,6 о . Во время предварительного изменения среды полученную смесь инкубируют при комнатной температуре пли при температуре окружающей среды, а именно около 25" С, в течение одной минуты,Фиксатив прибавляют к инкубиоованной смеси при перемешиванпи и поддерживают его рН нейтральным. Предпочтительным фиксативом является сбуферированный фосфатом раствор формальдегида; его рН находится в интервале 6 - 8. Затем смесь инкубируют при 55 - 62 С в течение 2 лан, предпочтительно 2 мин при 58 С. Затем смесь разбавляют, если необходимо, и проводят оптические измерения.Для определения количества тромбоцитов смесь разбавляют подкисленным изотоническим солевым раствором; полученная смесь имеет рН от 2 до 4. Разбавление753346 Формула изобретения Составитель С. Малютина Техред А. Камышникова Корректор С. Файн Редактор Ч. Хубларова Заказ 8 оо/1015 Изд. М 400 Тираж 673 ПодписноеНПО Поиск Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж.Б 5, Раушская наб., д 4/5 Тип. Харьк. Фил. пред. Патент осущестляют суспензией с использованием 0,15%-ной уксусной кислоты - солевой раствор. При этом улучшается соотношение сигналов тромбоцитов к шумам, четкое,разделение тромбоцитов и похожих красных клеток и ейкоитов и хорошо сохраняются исходные индивидуальные объемы трсмбоцитов. Можно также, а в некоторых слу;аях предпочтительно, частично разбавить образец, добавляя изотонический солевой 10 раствор перед стадией обработки детертентом.Для определения белых кровяных клеток образец разбавляют путем добавления изотонического солевого раствора, пред почтительно после стадии инкубации. Образец может быть разбавлен и перед стадией обработки детергентом. Разбавленная суспензия белых кровяных клеток сохраняет морфологию белых клеток, позволяя 20 разделить неокрашенные белые клетки: помогцыо светорассеяния под малыми и большими углами, и дает возможность дифференцировать лимфоциты, моноциты, ейтрофилы и эозинофилы без окрашива ния.П р и ме р 1. К антикоагулированному цельному образцу крови (0,1 мл) прибавляют 0,32 мл 1%-ного раствора полиоксиэтилен 20 сорбитан монолаурата (в изото ническом солевом растворе), полученную смесь о "тавляют для инкубации при комнатной температуре в течение 1 мин.К смеси при перемешивании прибавляют сбуферированный фосфатом раствор фор мальдегида (0,42 мл), содержащий 8 об. % фор,мальдегида, и инкубируют,полученную смесь 2 мин прп 57 С. Определение белых кровяных клеток осуществляют путем добавления к инкубированной смеси 1,2 мл 40 изотоническаго солевого раствора, и с помощью светорассеяния тароводят подсчет белых кровяных клеток.Для определения тромбоцитов к инкубцрованной выше сме"и прибавляют 1,2 мл 45 изотонического солевого раствора. Прибавляют 0,1 мл полученной смеси к 4,0 мл 0,5%-ного раствора уксусной кислоты - изотоничеокого солевого раствора. С помощью светора "сеяния проводят подсчет тромбоцитов и измерение их размеров. П р и м е р 2. Разбавляют 0,0 мл ацтикоагулированной капиллярной цельной крови в соотношении 1:10 изотоническим оолевым раствором, и 0,1 мл полученной смеси прибавляют х 0,32 мл 0,125%-ного раствора полиоксиэтилен 20 сорбитан монолаурата (в изотоническом солевом растворе). Смесь инкубчруют 1 мик при комнатной температуре, к ней при перемешивании прибавляют 0,42 мл сбуферированного фосфатом раствора формальчегида, содержащего 8 об. /, формальдегида, и инкубируют при 57 С в течение 2 мик.Дифференцированный подсчет белых кровяных клеток в приведенной выше суспензии осуществляют с помощью светорассеяния, Определение троибоцитов осуществляют прибавлением к инкубированной выше:м.- си 1,2 мл изотонического солевого раствора, 0,1 мл полученной смеси прибавляют к 1,0 мл 0,5%-ного раствора уксусной кислоты - изотонический солевой раствор. С помощью светорассеяния проводят подсчет тромбоципов и измерение их размеров,Предлатаемьй способ позволяет дифференцировать тромбоциты от лейкоцитов и эритроцитов. Способ получения суспензии,клеток путем обработки срови формальдегидом, добавления гемолизирующего агента, о т л и. ч а ю щ и й с я тем, что, с целью обе:печения возможности дифференциации тромбоцитов от лейкоцитов и эритроцитов, перед введением форма,пьдегида кровь обрабатывают детергентом, та 1 ким как полиоксиэтилен 20 сорбитан монолаурат концентрации от 0,3 до 2,0% по отношению к смеси, при рН от 6 до 8 с последующим инкубированием смеси прои температуре от 55 С до 62 С в теч ен ие 2 мин. Источник информации, принятый во внимание при экспертизе:1. Патент США3741875, кл, С 12 Р 1/04, опубл, 1973.