Способ получения аденозин-5 -трифосфата

Союз Советских Социалистических Республик(22) Заявлено 180478 (21) 2607827/23-04 (51) М. Кл,2 С 07 Н 19/16//А 61 К 31/495 с присоединением заявки Мо(23) Приоритет Государственный комитет СССР по делам изобретений и открытий(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АДЕНОЗИН-ТРИФОСФ Изобретение относится к усовершенствованному способу полученияаденозин-трифосфата (АТФ), который широко применяется в биологии,биохимии и медицине,Известен способ получения АТФпутем биофосфорилирования аденозинаФерментативной системой пивныхдрожжей в присутствии неорганическихфосфатов, источников ионов калия имагния, углеводов и толуола с последующим подкислением до рН 2,53,0 и выделением конечного продуктаионообменной хроматографией на амфотерном ионите БАК при рН З,О,Выход трифосфата 40-45, Чистота 95100 (1).Недостатком известного способаявляется высокий расход адсорбентавследствие невысокой рабочей обменной емкости ионита по отношению каденозинфосфатом (40-80 мг нуклеотидов на 1 г смолы) из-эа сильноговлияния при рН 2,5-3,0 конкурирующих ионов фосфата, ацетата, хлорида,присутствующих в реакционной смесипосле отделения дрожжевого шламма,Кроме того выход целевого продуктасравнительно низок (40-45), так как часть аденозинфосфатов вообще не сорбируется, проходя через ноно обменную колонну при рН 2,5-3,0 в малодиссоциированном виде. Выбор рН сорбции обусловлен амфотерной природой смолы БАК, которая как анионит работает только при рН менее 3,Иелью изобретения является повышение выхода целевого продукта,Это достигается тем, что для прекращения реакции биофосфорилирования реакционную смесь подкисляют до рН 4,5-4,8 и ионообменную хроматографию проводят на сильноосновной ионообменной смоле, что позволяет увеличить выход целевого продукта до 72Предлагаемый способ полученияЯаденозин-трифосфата заключается в биофосфорировании аденозина ферментативной системой пивных дрожжей в присутствии неорганических фосфатов, источников ионов калия и магния, углеводов и толуола, с последующим подкислением до рН 4,5-4,8, в проведении ионообменной хроматографии на сильноосновной ионообменной смоле, Выход АТФ 70-72, Чистота 96-100.722920 Формула изобретения Составитель Л, Никулина Редактор Н, Данилович Техред М.Келемеш Корректор Т, СкворцоваЗаказ 307/14 Тираж 495 ПодписноеПНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул, Проектная, 4 П р и м е р 1, 500 г аденозинарастворяют в 18 л деминерализованной воды. К раствору добавляют2170 г Ба НРО 12 Н О, 504 г КН РОд,36 г КС 1, 1 кг сахарозы, 56 гМдСЕ, - б Н,О, 36 л пивных дрожжейи 750 мп толуола,Устанавливают рН 7,0 + 1, Т37 + 1 ОС. За ходом реакции следятпо изменению рН. Время фосфорилирования 3 ч., Для прекращения реакциидобавляют ледяную уксусную кислотудо рН 4,5 и смесь охлаждают до+ 4 С. Отфильтровывают дрожжевойшламм и фильтрат разбавляют 4-5кратным объемом деминерализованнойводы. Полученный раствор с рН приблизительно 4,6 наносят на колонну с анионитом,: соотношение диаметра и высоты колонны 1:4; 2,8 кганионита АРАП (коэффициент набухания 2,5-3,6), После сорбции колоннупромывают 50 л воды и 0,004 и, раствором соляной кислоты.АДФ элюируют 0,02 н, растворомБаСЕ в 0,01 н, НСЕ, АТФ дЕсорбируют0 5 н. раствором БаСР в .0,02 н, НС 6,АТФ осаждают, смешивая элюат с10-кратным объемом этилового спирта.Осадок фильтруют, растворяют в 7 лдеминерализованной воды, добавляют65 г хлористого натрия, устанавливают рН 1,8 раствором НС 0 и смешиваютс 7 л этилового спирта, Кристаллизуется динатриевая ссль аденазинтрифосфорной кислоты, Выход 680 г,Чистота 98.Элюат процесса сорбции направляется на выделение аденозина и АТФдля возвращения их в реакцию биофосфорилирования.П р и м е р 2. 25 г аденозинарастворяют в 800 мл деминерализованной воды, К раствору добавляют108,5 г Ба НРО 12 Н О, 25,2 гКН РО, 1,8 г КСР, 1,8 г МдС 6 хбНО, 50 г сахара и .1,3 л пивныхдрожжей. Условия фосфорилирования как ив примере 1, Реакцию прекращают добавлением ледяной уксусной кислотыдо рН 4,6, Отфильтровывают дрожжевую массу, фильтрат разбавляют 4 кратным объемом воды (рН 4,8) и наносят на ионообменную колоннуг0,13 кг анионита АРАП; соотношениедиаметра и высоты колОнны 1:5. Разделение аденозинфосфатов проводят,как описано в примере 1, ФракциюАДФ концентрируют до содержания АДФболее 10,Раствор с рН 1 смешивают с10-кратным объемом этилового спирта.Осаждается натриевая соль АДФ, Выход 4,2 г, Чистота 96,15 АТФ осаждают из элюата 10.-кратным объемом этилового спирта, осадок отфильтровывают, растворяют в400 мл. воды добавляют 3,5 г хлористого натрия, подкисляют до рН 2,3,20 кристаллизуют динатриевую соль АТФдобавлением 400 мл этилового спирта,Выход 33 г, Чистота 99,25Способ получения аденозин-трифосфата путем биофосфорилированияаденозина ферментативной системойпивных дрожжей в присутствии неорга нических фосфатов, источников ионовкалия и магния, углеводов и толуола с последующим подкислением и выделением конечного продукта ионообменной хроматографией, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью. повышения выхода целевого продукта, подкисление проводят до рН 4,5-4,8 и ионообменную хроматографию осуществляютна сильноосновной ионообменной смоле,40Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Авторское свидетельство СССРР 395082 по заявке 1698592/31-16,кл, А 61 К 31/495, заявл, 197145 (прототип) .