Способ индикации

Союз Сфветскик Сещиалнстнческид РеспубликП" О ИСААКИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ оц 712441(22) Заявлено 31,0778 (21) 2651252/28-13с присоединением заявки Нов(51)М, Кл.2 С 12 К 1/04 Государственный комитет СССР о делам изобретений и открытий(72) Авторы изобретения Научно-исследовательский ордена Трудового Красного Знамениинститут эпидемиологии и микробиологии им.акад.Н.Ф.Гамалеии Казахский научно-исследовательский институт эпидемиологиии микробиологии(54) СПОСОБ ИНДИКАЦИИ МУСОРТАБМА РВЕПМОНХАЕ Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для ускоренной диагностики Мусор 1 аэпа рпецпюп 1 ае. 5 Известен способ индикации МусорТавва рпецвоп 1 ае в смывах путем иммуноФлюоресцентного исследования маз" ков (1 .Однако известный способ позволяет выявить возбудитель лишь у 50-754 больных с инфекцией Мусор 1 аэща рпеивопдае.Целью изобретения является повышение эффективности способа.15Эта цель достигается тем, что смывами заражают эксплантаты трахеи Цыплят,обработанные стафилококковым токсином, культивируют их в питательной среде при температуре 33-37 С в течение 3-5 дней и затем готовят мазки-отпечатки.П р н м е р , От больных пневмониями производят забор носоглоточных или бронхиальных смывов с помощью сухих стериальных ватных тампонов и помещают их в пенициллиновые флаконы, содержащие по 2 мл среды 199 с 0,5 Ъ желатины н пенициллин 1000 ед/мл. В .лаборатории тампоны со смывами тщательно отжимают пастеровской пипеткой и полученную мутно.ватую жидкость отсасывают в другие стерильные флаконы. Не позднее 1 ч после забора материала должно быть проведено заражение эксплантатов трахеи.Для приготовления эксплантатов используют ткань трахеи 3-10-дневных цыплят, которых выращивают в условиях термостатаиэ развивакщихся куринных эмбрионов. После извлечения трахею тщательно отмявают от крови в чашках Петри раствором Хенк" са с пенициллином 200 ед/мл. Затем в свежей чашке Петри для получения кольцевндных Фрагментов трахеи проводят разрез.лезвием бритвы но межхрящевым промежуткам. Кольца трахеи дополнительно отмывают в растворе Хенкса. Их ткани трахеи одного цыпленка готовят обычно 24 трахеальных кольца. Фрагменты трахеи в количестве трех колец помещают в пенициллиновый Флакон, содержащий 1 мл среды 199; проводят. пипетированне с целью промывания просвета трахеальных колец. После удаления среды из флакона вводят 0,1 млФормула изобретения Составитель С,МалютинаТехред О.Легеза Коррек тор М, Шароши Редактор 3 . ХодФк ОЦР Заказ 10028/8 ТиРаж 522 Подписное ЦИНИПИ Ресударственного комитета СССР, Пс двпам изобретений и открытий 113035, Москва, К, Раушская наб., д. 4/5Филиал ППП Патент, г,Ужгород, ул . Проектная, 4 стафилококков ого токсина (исходныйгемолитический титр 1:1 б 00) в разведении 1:32.- 1:б 4 (разведениепроизводят в среде 199); оптимальная концентрация токсина, не обладающая цитотоксическим действием,. опре"делена путем титрования в культуре клеток куриных фибробластов, за-.раженных эталонным штаммом я,рпецщо-.п 1 ае, Контакт ткани трахеи и токсинадают в течение 15-20 мин. Далее 1 Оне отсасывая токсин, во Флаконы вносят 0,2-0,3 мл носоглоточного илибронхиального смыва больных. Инфицирование эксплантатов проводят путемнепосредственного контакта тканитрахеи и смыва в течение 30 мин. Наодин исследуемый материал берут 2флакона с эксплантатами трахеи. Поистечении времени контакта во Флаконы наливают 1 мл питательной среды,состоящей иэ среды 199 с 2 Ъ нормальной лошадиной сыворотки без консерванта и 10 дрожжевого экстракта.Зараженные эксплантаты трахеи инкубируют,при 35+2 С. Спустя 3-5 сутокпосле культивирования инфицированныхэкеплантатов из них готовят мазкиотпечатки путем прикладывания слизистой трахеи на поверхность обезжиренных предметных стекол (с каждогокольца трахеи снимают по 3 отпечат- ЗОка). Далее препараты высушивают, Фиксируют в смеси Никифорова в течение10-15 мин. После фиксации препаратыисследуют непрямым методом иммуноФлюоресценции по Кунсу с использова.нием гипериммунной кроличьей сыворотки против М.рпеищоп 1 ае с титром1:320 и выше: на препараты с отпе-.чатками, помещенные во влажную камеру .(чашки Петри) наносят 1 каплюиммунной сыворотки и инкубируют их фпри температуре 37 ОС в течение 30 мин,После этого препараты отмывают вдвух сменах забуференного физиологического раствора (рН 7,2) и споласкивают дистиллированной водой. Наслегка подсушенный препарат наносяткаплю антикроличьей флюоресциирующейсыворотки осла, разведенную дорабочего титра 1:8 (используют меченую Флюоресциинизотиоционатом (ФИТЦ) сыворотку), После 20-минутной инкубации во влажной камере при З С препараты отмывают в течениеУО30 мин в Физиологическом растворе (рН 7,2), затем водой и просматривают после просушки и нанесения глицерина в люминесцентном микроскопе МЛили ЛЮМАМ в падающем свете.Предлагаемый способ более чувствительный и позволяет выявиТь возбудитель у больных в 2-4 раза чаще, Чем известный способ. Так, при исследовании мазков, приготовленных непосредственно из смывов больных, антиген М.рпеыпоп 1 ае выявлен лишь у 2 иэ 27 больных, а при исследовании мазков-отпечатков чз зараженных смывами эксплантатов трахеи дополнительно еще у б больных. Известный способ выявляет антиген М,рпешпоп 1 ае только у двух, а предлагаемый способ - у всех четырех больных с нарастанием титра специФических антител и дополнительно у четырех больных без сероконверсии к М.рпеапоп 1 ае. Поэтому использование предлагаемого способа выявления обеспечивает по сравнению с известным способом более высокий процент обнаружения М,рпещвоп 1 ае у больных. Способ индикации Мусор 1 азща рпецщоп 1 ае в смывах путем иммунофлюаресцентного исследования мазков, о т л и ч .а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения эффективности способа, смывами заражают эксплан- . таты трахеи цыплят, обработанные стафилококковым токсином, культивируют их в питательной среде при температуре 33-37 С в течение 3-5 дней и затем готовят мазки-отпечатки. Источники информации принятые во внимание при экспертизе 1, Ж,Микробиология , 1972,Р 11, с,2 4-27,