Способ получения лизоцима

) ате"ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз Севетскик Социалистических Республик(51)М. Кл. с присоединением заявки Мо С 12 Э 13/10 Государственный комитет СССР по делам изобретений и открытий(23) Приоритет Опубликовано 3 Ц 01,80, Бюллетень М 9 4 Дата опубликования описания 300 1,80(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИЗОЦИМА 25 30 Изобретение относится к способу получения лизоцима, широко применяемого в разных областях народного хозяйства, в частности в пищевой про.мышленности, медицине, микробиологии.Известны различные способй получения лизоцима из животного и микробиологического сырья. Наиболее доступным сырьем животного происхожде ния для выделения лиэоцима является яичный белок. Согласно известному способу 1 получения лиэоцима иэ. яичного белка исходное сырье обрабатывают раствором хлористого натрия и едкого натра, осуществляют кристаллизацию фермента из раствора и отделяют кристаллы иэ стабилизированного раствора фильтрацией, при этом кристаллизацию фермента осуществляют трехкратной перекристаллиэацией. Выход лиэоцима от общего его количества в яичном белке - 80-95, температура хранения 3-4 ос. Недостатками известного способа являются сложность и длительность процесса, что ведет к тому же к потерям ферментного препарата. Препарат малоустойчив при температуре 18-23 оС, поэтому его необходимо хранить при низкой температуре,Цель изобретения - получение устойчивого при хранении раствора препарата и упрощение процесса его полученияДля достижения этой. цели согласно предлагаемому способу кристаллизацию фермента иэ раствора ведут втечение 4-6 суток, после отделениякристаллов лиэоцима рН раствора препарата устанавливают равным 3,55,0 и стабилизируют раствор хлористым натрием и альбумином, которыеберут в соотношении 1-15:1,Целесообразно установить ".оотношение лизоцима и хлористого натрияравным 1,00-1,25:1,00-5,00, а соотношение лизоцима и альбумина1,0 в 0,4-0,9,Предлагаемый способ заключаетсяв следующем.Яичный белок обрабатывают растворами хлористого натрия и едкогонатра с последующим отделением кристаллов лизоцима иэ раствора фильтрацией, перекристаллнзацией и стабилизацией ферментного препаратасолью одновалентного катиона, например, натрием хлористым или альбумином. В качестве стабилизатора используют комплекс натрия хлористого иальбумина. При этом натрий хлористыйвводят в суспензию лиэоцима, содержащую альбумин, сразу же после первойперекристаллизации, не выделяя целевой продукт из раствора, при одновременном установлении значения,рН 3,5-5,0; соотношение натрия хлористого и.альбумина 1-15:1, соотношение лизоцима и натрия хлористого1-1,25;1,0-5,0,Предлагаемый способ получения лизоцима обеспечивает упрощение процесса в результате исключения двух стадий перекристаллизации, обессоливанияи высушивания. Это дает экономиюрабочего времени до 70 и снижает потери конечного продукта на 4-6.Использование в качестве стабилизатора комплекса натрия хлористогои альбумина в соотношении 1-15:1(соотношение лизоцима и натрия хлористого в суспенэии 1-1,25:1,0-5,0)дает возможность получать ферментныйпрепарат, устойчивый при хранениипри температуре 18-23 С.Известно, что одно-, двух-, трех"валентные катионы, в том числе натрийхлористый, в микроколичествах являются необходимыми активаторами лизоцима. Однако не .обладает свойствамистабилизатора.В качестве .стабилизатора предло"жено использовать высокие концентрации натрия хлористого (4-30 от общего сухого веса) и сочетании с альбумином при рН 3,5-5,0 и концентрации Фермента в суспензии 4-6,При значениях рН 8,0-9,0 натрийхлористый подавляет ферментативнуюактивность уже при концентрации50 мИ, При низких значениях рН(3,5-5,0) снижается ингибирующеедействие натрия хлористого.Лизоцим с альбумином образуюткомплекс, который улучшает его устойчивость и увеличивает активность,В нейтральных средах при рН 7,0-6,0комплекс наиболее устойчив.При снижении рН устойчивость комплекса снижается, и лизоцим сравнительно легко может высвободиться изкомплекса. Таким образом, альбуминодновременно является стабилизатором,при рН 3,5-5,0 не блокирует активность лизоцима, что важно при практическом его применении,При соотношении лизоцима и натрияхлористого 1-1,25:1-5 имеет местоодновременная стабилизация и стерилизация фермента, так как исключается развитие прсторонней микрофлоры,П р и м е р. К 80 л яичного белкапри перемешивании добавляют 4,5 кгнатрия хлористого и добавляют 1 н,раствор едкого натра до значения15 2 О 25 ЗО 35 40 45 5 О 55 рН 9,5, При достижении рН 9,5 дополнительно добавляют натрий хлористыйиэ расчета 52,2 г на каждый литрдобавленного раствора едкого натра,чтобы конечная концентрация приготовленного раствора была 5Полученный раствор фильтруют. К однородноМу раствору добавляют 1-2 г кристаллического лизоцима (в качестве затравКи) . Процесс кристаллизации лизоцимазавершается через 4-6 суток притемпературе 2-5 С. Суспензию кристаллов центрифугируют при 2500 об/мин,2-50 С в течение 30 мин. Выход. -4,0 л суспенэии из кристаллов лизоцима.Приготовление стабилизированноголизоцима. К 4,0 л суспенэии добавляют5 н.раствор уксусной кислоты, доводят значение рН до 4,0. При этом расходуют 1,12 л 5 н.раствора уксуснойкислоты. Содержание натрия хлористого в суспенэии после доведения рНдо 4,0 составляет 4,0. Дополнительно добавляют при перемешивании 252 гнатрия хлористого, т.е. до содержания нас Е 10,По электрофоретическим данным белок суспензии состоит из 62 лиэо-.цима и 38 яичного альбумина (.соотношение 1:0,61). Соотношение лиэоцимаи альбумина является оптимальным ине требует изменений. Срок храненияи транспортировка стабилизированнойсуспенэии лизоцима при температуре18-23 С составляет 6 месяцев.Формула изобретения1. Способ получения лизоцима изяичного белка, предусматривающийобработку исходного сырья растворомхлористого натрия и едкого натра,кристаллизацию Фермента иэ раствораи отделение кристаллов из стабили-.зированного раствора фильтрацией,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, сцелью получения устойчивого при хранении раствора препарата и упрощения процесса его получения, кристаллизацию осуществляют в течение 46 суток, после отделения кристалловлизоцима рН раствора препарата устанавливают равным 3,5-5,0 и проводятстабилизацию раствора хлористымнатрием и альбумином, взятых в соотношении 1-15:1.2. Способ по и1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что соотношение лизоцима и хлористого натрия устанавливают равным 1,00-1,25 ф 1,00-5,00,3. Способ по п.1, о т л и ч а ю -щ и й с я тем, что соотношение лиэоцима и алъбумина устанавливают1 ю 030,4-0 с 9Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1, Авторское свидетельство СССР9247703, кл, С 12 О 13/10, 1968 (прототип),