Способ получения раствора нативного гемоглобина

(22) Заявлено 16,0 1) 2323121/ аявкирисоединением 23) Приоритет 3) Опубликовано 30,01.78. Бюллетень4 Государстееннын комитет Совета Министров СССР по делам изобретенийи открытий 3) УДК 615.45:612.1(45) Дата опубликован Авторыизобретения Е. П. Вязова, Н. А., А, ХачатурьянМ, Морозова,А. Ажигирова,доров, В. Б. Коена Ленина науматологии и пер Г. Я. Розенберг, А Ю, Г, Иванов, Г. С. Бойко,аявител но-исследовательскеливания крови инстит 4) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТВОРА НАТИВНОГО ГЕМОГЛОБИНА еще 35 мин, Для разделения компонентов смеси (органический растворитель, стромы, раствор гемоглобина) ее центрифугируют 20 мин при 2000 об/мин и +4 С.По окончании центрифугирования раствор гемоглобина, находящийся в верхней части центрифужного стакана, сливают, фильтруют через фильтр Миллипор (63) и диализуют против раствора Кребса.Ниже приводятся характеристики гемоглобина, полученного предлагаемым способом.При исследовании прокоагулянтной активности гемоглобина с помощью теста потребления протромбина по Квику, разница между контрольной (донорская кровь+ физиологический раствор) и опытной (донорская кровь+ +раствор Нв) пробами отсутствует, что свидетельствует о полном удалении стромальных веществ, обладающих тром бопластической активностью.Исследование кислородно-диссоциационных кривых гемоглобина (при 20 С в 0,1 М фосфатном буфере рН 7,2) дает значения: 1 оРзюО = 0,78+ 0,02 и и = 2,8+ 0,2, соответствующие характеристикам нативного гемоглобина.Содержаниеобразцах ниже Изобретение относится к области выделения белков из объектов биологического происхождения и может быть использовано для получения гемоглобина, не содержащего прокоагулянтов.Известен способ получения раствора натив- ного гемоглобина, заключающийся в том, что к эритроцитарной массе при 10 - 12 С добавляют от 4 до 12 г р-пропиолактона 1 л осадка эритроцитов, смесь выдерживают 25 мин, за тем центрифугируют и раствор очищают.Выход целевого продукта составляет 6 - 7%.Однако известный способ не обеспечивает высокой концентрации и чистоты целевого продукта. 1Целью изобретения является повышение концентрации и чистоты целевого продукта.Это достигается тем, что обработку проводят тетрахлорэтиленом при нагревании смеси от +4, +6 С до +35, +38 С в течение 2 10 - 15 мин.П р и м е р. К эритроцитной массе, отмытой 4 раза 0,9%-ным раствором хлористого натрия, добавляют при температуре +5 С охлажденный до той же температуры тетрахлорэти лен в соотношении 1:1. Смесь перемешивают при +5 С в течение 10 мин, затем температуру повышают до 37 С и продолжают гемолиз мет-гемоглобина в полученных5%,589984 Концентрация гемоглобина о 4 Осмотнческое давление мм вод. ст.5 10 15 21 216 448 776 1256 Формула изобретения 30 Составитель С. МалютинаТехред Н. Рыбкина Корректор Т, Добровольская Редактор Г. Лановая Заказ 3275/10 Изд.202 Тираж 693 Подписное НПО Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раугпская наб д. 4/5Типография, пр, Сапунова, 2 Молекулярный вес гемоглобина, определенный методом светорассеяния, равен 65000+ + 4500.Определение осмотического давления гемоглобина в различных концентрациях на мембранном осмометре при 37 С в физиологическом растворе КаС 1 дает следующие значения: Молекулярный вес, подсчитанный на основании данных по осмотическому давлению в диапазоне концентраций от 0,5% до 1,5%, равен 64000 (+ 10/о)Относительная вязкость полученного раствора гемоглобина при его концентрации, равной 10%, при 20 С составляет 1,4.Полученный предлагаемым методом гемоглобин нетоксичен при внутривенном введении мышам в дозе до 9 г/кг веса, переносим крысами при плеторическом переливании в количестве до 4 г/кг веса тела, выведение его с мочой происходит аналогично гемоглобину, очищенному методом центрифугирования.В опытах на изолированном сердце кролика с перфузией коронарных сосудов гемоглобином получен ответ на основной, принципиальный вопрос: показано, что раствор гемоглобина способен связывать, переносить и отдавать тканям кислород.Артерио-венозное различие по кислороду составляет в среднем 3,5 об, %.Раствор гемоглобина был испытан на кошках, у которых путем обменных переливаний 4замещали собственную кровь на раствор гемоглобина. Объем замещения составлял от 2до 3 по отношению к объему собственной кро 5ви, При этом у животного оставалось собственных эритроцитов от 0,2 до 1 млн., а показатель гематокрита был равен 1 - 5,Раствор гемоглобина поддерживал жизньживотного от 2 до 6 ч, при этом перенос газов осуществляется в основном за счет рас 10 творенного гемоглобина,По показателям артериального и венозногодавления минутного объема сердца и периферического сосудистого сопротивления, растворгемоглобина поддерживает в удовлетвори 15 тельном состоянии гемодинамику в течениевремени наблюдения (2 ч) .Использование предлагаемого способа получения нативного гемоглобина дает возможность получения высоких концентраций20 (30%) гемоглобина, исключить этап центрифугирования при больших ускорениях, чтозначительно упрощает технологию, сокращает время, затрачиваемое на процедуру очистки и позволяет получать практически неогра 25 ниченные количества гемоглобина. Способ получения раствора нативного гемоглобина, включающий обработку эритроцитов органическим растворителем с последующим отделением органической фазы, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения концентрации и чистоты целевого продукта, обработку проводят тетрахлорэтиленом при нагревании смеси от +4, +6 С до +35, +38 С в течение 10 - 15 мин.40 Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1, Патент Франции М 2202102, кл. А 61 К27/10, 1973.