Способ получения клеток костного мозга для цитологического исследования

(5 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИПРИ ГКНТ СССР ИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ОПИ ВТОРС ВИДЕТЕЛЬСТВУ(71) Научно-исследовательский институтфармакологии Томского научного центраАМН СССР(56) Авторское свидетельство СССРМ 1633318, 1989.(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА ДЛЯ ЦИТОЛОГИЧЕСКОГОИССЛЕДОВАНИЯ Изобретение относится к конкретно к гематологии, и може пользовано для изучения эндот форм гемопоэтических островков при различных патологических с системы крови (анемии, лейкопен цитозы, эритроцитозы, облучени ское воздействие на гемопоэз и Целью изобретения является эндотелиоидных островков. Способ осуществляют следуюмедицине, т быть иселиоидныхв норме и остояниях ии, лейкое, токсичедр.) получение щим об зг вместе с костью и в течение 60-90 минтворе коллагеназы, 37 С в течение 30-4астворе тоипсина, фим растворе глютарово механически разбива наслаивают на среду ; фиколл1,9-2,85 3,0-4,5; верографин центрифугируют при нкубив 0,1- затем 5 мин в кси руго альют его состо; диат-45;1000 зом. Костный мо руют при 37 С 0,2%-ном рас инкубируют при 0,2-0,3%-ном р ют в 0,125%-но дегида 10 мин,на фрагменты,ящую из мас,% риозат натрия вода - до 100,(57) Изобретение относится к медицине, точнее к гематологии. Целью изобретения является выделение эндотелиоидных островков из костного мозга. Для этого костный мозг вместе с костью инкубируют в растворе ферментов, наслаивают на среду, состоящую из фиколла 400, диатриозата натрия, верографина, собирают слой, содержащий фракцию, обогащенную эндотелиоидными клетками, и окрашивают гематологическими красителями,1500 об/мин в течение 5-10 мин, собирают интерфазный слой(расположенный над средой и содержащий обогащенную фракцию эндотелиоидных островков) и окрашивают гематологическими красителями.П р и м е р 1. Бедренную кость мышей линии СВА помещают в 1 мл.0,15%-ного раствора коллагеназы и инкубируют при с) 37 С в течение 70 мин, переносят в 0,25%- а ный раствор трипсина на 40 мин при 37 С. после чего фиксируют в 0,125%-ном растворе глютарового альдегида 10 мин, вымывают содержимое бедренной кости дистиллированной водой, разбивают костный мозг на фрагменты и наслаивают на среду, состоящую, г; фиколла3,5, диат- а риозат натрия 5,0; 50,0 г верографин 50,0; вода - до 100, центрифугируют при 2000 об/мин в течение 15 мин, Затем фрагменты костного мозга, расположенного над указанной средой, собирают и окрашивают акридиновым оранжевым. Анализ морфологического состава ГО показал (таб 1721467лица), что среди них присутствовали только макрофагальные или фибробластоидные, но не эндотелиоидные островки.П р и м е р 2. Бедренную кость мышей линии СВП помещают в 1 мл 0,15-ного раствора коллагеназы и инкубируют при 37 С в течение 70 мин, переносят в 0,25 - ный раствор трипсина на 40 мин при 37 С, фиксируют в 0,125-ном растворе глютарового альдегида 10 мин, вымывают содержимое костномозгового канала дистиллированной водой, разбивают костный мозг на фрагменты, наслаивают на среду, состоящую, г: фи колл1,9; диатриозат натрия 3,0; верографин 30,0, вода - до 100, и центрифугируют при 1500 об/мин в течение 10 мин, Затем фрагменты костного мозга, расположенные надуказанной средой, собирают и окрашивают акридиновым оранжевым. Анализ морфологического состава ГО показал (таблица, фото), что наряду с макрофагальными и фибробластоидными островками определяет ся еще один тип ГО - эндотелиоидный.П р и м е р 3, Бедренную кость мышей линии СВА помещают в 1 мл 0,15 -ного раствора коллагеназы и инкубируют при 37 С в течение 70 мин, переносят в 0,25 - ный раствор трипсина на 40 мин при 37 С, фиксируют в 0,125 -ном растворе глютарового альдегида 10 мин, вымывают содержимоекостномозгового канала дистиллированной водой, разбивают костный мозг на фрагменты, которые наслаивают на среду, состоящую, г; фиколл2,5; диатриозат натрия 3,5; верографин 40,0; вода - до 100, и центрифугируют при 1250 об/мин в течение 7 мин. Затем фрагменты костного мозга, расположенные над указанной средой, собирают и окрашивают акридиновым оранжевым, Анализ морфологического состава ГО показал (таблица, фото), что наряду с макрофагальными и фибробластоидными островками определяется еще один тип ГО - эндотелиоидный.П р и м е р 4. Бедренную кость мышей линии СВА помещают в 1 мл 0,15 -ного раствора коллагеназы и инкубируют при 37 С в течение 70 мин, переносят в 0,25 - ный раствор трипсина на 40 мин при 37 С, фиксируют в 0,125 -ном растворе глютарового альдегида 10 мин,.вымывают содержимое костномозгового канала дистиллированной водой, разбивают костный мозг на фрагменты, которые наслаивают на среду, состоящую, г; фиколл2,85; диатриозат натрия 4,5; верографин 45,0; во 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 да - до 100, и центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 мин. Затем фрагменты костного мозга, расположенные над указанной средой, собирают и окрашивают акридиновым оранжевым. Анализ морфологического состава ГО показал (таблица, фото), что наряду с макрофагальными и фибробластоидными островками определяется еще один тип ГО - эндотелиоидный,П р и м е р 5, Бедренную кость мышей линии СВП помещают в 1 мл 0,15 -ного раствора коллагеназы и инкубируют при 37 С в течение 70 мин переносят в 0,25 - ный раствор трипсина на 40 мин при 37 С, фиксируют в 0,125 -ном растворе глютарового альдегида 10 мин, вымывают содержимое костномозгового канала дистиллированной водой, разбивают костный мозг на фрагменты, которые наслаивают на среду, состоящую, г: фиколл1,0; диатриозат натрия 2,0; верографин 25,0; вода - до 100, и центрифугируют при 500 об/мин в течение 3 мин. Анализ морфологического состава ГО (таблица) показал, что ни в одном случае эндотелиоидные островки обнаружены не были,Предлагаемый способ позволяет получить в неразрушенном виде эндотелиоидные островки, изучить их структуру, исследовать межклеточные взаимосвязи, определить качественный состав ассоциированных с эндотелиоидными элементами гемопоэтических островков, что может быть использовано в гематологии для оценки состояния кроветворной ткани в норме и при различных патологических состояниях (анемии, лейкозы,.лейкопении, токсические повреждения, действие излучения и др.).Формула изобретения Способ получения клеток костного мозга для цитологического исследования путем инкубации костного мозга вместе с костью при 37 С в 0,1-0,2 -ном растворе коллагеназы в течение 60-90 мин, затем в 0,2-0,3- ном растворе трипсина в течение 30-45 мин, фиксации в 0,125;4-ном растворе глютарового альдегида в течение 10 мин с последующей механической разбивкой и окрашиванием, отл ич а ю щи й с ятем, что, с целью получения эндотелиоидных островков, костный мозг после механической разбивки дополнительно наслаивают на среду, состоящую из 1,9-2,85-ного водного раствора фиколла, 3,0-4,5 -ного раствора диатриозата натрия и 30-45 -ного раствора верографина, и центрифугируют при 75-100 С в течение 5-10 мин.