Способ микробиологического синтеза рибофлавина

" ьеФйоеооюзналеееде 1 тно техиичоокул6 бди ека БА 389132 ИЗОБРЕТЕНИЯ Союз советских Социалистических РеспубликК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ависимое от авт. свидетельствааявлено 0111.1971 ( 1631379/30-15 М. Кл. С 120 5/О с присоединением заявк Государственный комитеСовета Министров СССРпо делам изобретенийи открытий Приоритет ДК 663:577.164973. Бюллетень Мописания 15.Х 1,197 публиковано 05,Ч публиковани Авторыизобретения И. Алиханян, А, И,и Л. А.научно-исследов екции промышле Степанов, В. Г. ЖданМинеева Заявител юзный и сел ельскии институт генетикиых микроорганизмов СПОСОБ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО СИНТЕЗА РИБОФЛАВИНАПриготовлениечает три стадии: 1) выращиваниета на косяках с псредой; 2) прнготовлени нем грибапродуце 3) засев посевспор, смытых с пш бачпродуцен- гаризованной культурыитательной ыращпвание на ов суспензией е пшена 1та; ых аппа на. 1. Вы 1)ащпвание культурыкосяках с питательной агаризоСуспензию спор гриба готовной на соевых косяках культув чашки Петри с дрожжевойсредой, содержащей, г:Дрожжевой экстрактПептонГлюкозаАгар продуцепта на ванной средой. ят с выращеной и рассевают агарпзованной 31020 тср- соли- евой роводнойт при 0,5 а осьми дне С выросш ересевают средой, сод оды рН средыти в течение 301 инкубацин вие колонии вна косяки с сержащей, г:501020,На 1 л водоп 6,7. Стерллнзую После семн-в 25 мостате при 30 честве 10 шт.;и агаризованной Соевая м Саха,р Аука Известйы способы многоступенЧатого выра. щивания гриба Егепюйес 1 цп 1 аз 11 Ьу 11 в микробиологическом производстве рибофлавина на питательных средах, содержащих мясной бульон. 5Так, например, культуру, гриба Егетпойе. с 1 птп аз 11 Ьу 11 (вторая генерация), выращенную Йа косяках с агаризованной соевой средой, засевают в колбы с мясным бульоном. До момента передачи культуры в посевные аппара ты проходит пять - семь дней, что отрпцательно влияет на ее качество и соответственно на уровень синтеза витамина. В процессе многократных пересевов культуры накапливаются низкоактивные формы, что снижает ее продук тивность. Указанный недостаток существующей технологии приготовления посевного материала для заводских аппаратов является одной из главных причин,низкого уровня синтеза витамина в промышленных условиях. 20 Кроме того, существующий способ не обеспечивает его стандартность и стерильность, что в значительной мере, нарушает ритмичность работы микробиологических предприятий, производящих рибофлавин.Предлагаемый способ микробиологического синтеза рибофлавина включает приготовление посевного материала, ферментацию, высушивание культуральной жидкости и мицелию гриба. 30 осевного материала вклю389132 рН 6,6 - 6,7 ЦНИИПИ Заказ 303,11 Изд. ЬГа 94 Тираж 467 Подписное Сапунова 2 Типография, пр,Йа 1 л водопроводной воды рН 6,8 - 7,0.Стерилизуют при 0,5 ати 30 мин.Культуру с каждого косяка проверяют на уровень образования рибофлавина. Для этого семисуточную культуру продуцеььта, выращенную на косяках, пересевают в колбы Эрлен- мейера на 750 мл, содержащих 100 мл питательной среды следующего состава, г/л водопроводной воды:Соевая мука 25 Гидрол 30 Кукурузный экстракт 30 Сахар 5 Солод 2,5 Мел (СаСОз) 5 ХаС 1 1 Дрожжи сухие 1 Реса 04 0,05 Хп 50, МпЬО 0,025 МдЮ, 0,7СаС 12 0,5 Среду стерилизуют при 1 ати в течение 3 минКультуру в колбах выращивают в течение 96 час при 30 С на качалке 200 - 220 об/мин.Синтез витамина определяют флуорометрическим методом. Лучшие по активности варианты используют,для получения культуры второй генерации. Для этого косяки с соевой агаризованной средой засевают водной сус. пензией спори мицелия культуры первой ге. нерации. Засев пшена производят водной сус пензией спор и мицелия продуцента с косяков Второй генерации после их инкубации (7 - 8 дней при 30 С),2. Приготовление пшена и выращивание на нем гриба Е. азЫэу 11.Пшенную крупу промывают холодной водой до полного удаления механических примесей и грязи в промывной воде. Промытое пшено заливают свежеприготовленной молочной сывороткой. Пшено выдерживают,на кипящей водяной бане,в закрытой эмалированной посуде 30 мин до полного набухания зерен. После 10 - 15 мин выдерживания пшено распределяют равным тонким слоем на пергаментную бумагу (не должно быть комков), подсушивают 10 - 15 мин и,расфасовывают по 50 г в стерильные стеклянные флаконы объемом 500 мл. Приготовленное таким образом пшено трехкратно стерилизуют в автоклаве при 110 С по 1 час в,течение трех дней, Пшено перед засевом культуры должно быть слабо разваренное, сыпучее, светлое. Перед засевом пшено проверяют на стерильность. Для засева пшена используют водную суспензию спор и мицелия культуры второй генерации. 5 мл суспензии спор и мицелия культуры стерильно переносят в каждый флакон, после чего пшено во флаконах встряхивают. Затем фла 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 коны в горизонтальном положении помешают в термостат при 30 С на семь-восемь дней при ежедневном встряхивании. Пшено после прорастания гриба приобретает желтый цвет. Содержание спор в каждом флаконе равно 4 - 5 10. Подсчет спор проводят в камере Горяева, а также рассевом в чашки Петри с дрожжевой агаризованной средой. Пшено со спорами гриба высушивают в вакууме прн разрежении 0,8 атм в течение 1 О - 12 час и температуре 20 - 25 С, Посевной материал должен быть проверен на отсутствие посторонней микрофлоры, жизнеспособность и способность к синтезу,рибофлавина. Срок хранения высушенного пшена три месяца, без подсушивания - месяц, в запарафинированных флаконах при комнатной температуре, в темноте.3. Засев посевных аппаратов суспензпей спор гриба, смытых с пшена.Культуру, выращенную на пшегге, используют для засева питательной среды посевных аппаратов (среда аналогична составу среды, описанной в разделе 1). Засев производят водной суспензией спор гриба, смытых с пшена. Для активации прорастания спор воднуго суспензию обрабатывают 1,5%-ным раствором перекиси водорода (конечная концентрация) в течение 1 мин. Для нормального развития гриба в посевных аппаратах необходимо со здать концентрацию спор порядка 100 в 2 спор на 1 мл среды. Например, в посевные аппараты объемом 1 м необходимо засеять 2 10 спор, Таким образом, для засева одного аппарата объемом 1 м достаточно одного флакона с пшеном.Предмет изобретении1, Способ микробиологического сийте 3 а рн бофлавина на питательной среде, включаю щей в качестве основных источников углево. дов, азота и фосфора гидрол, соевую муку и кукурузный экстракт соответственно, при аэробных условиях выращивания культуры продуцента и ферментации, отличающийся тем, что, с целью получения качественного и стандарпного посевного материала продуцснта рибофлавина аскомицета Егепьойес 1 пьп азЬЬу 11,:в качестве органического субстрата для выращивания культуры используют пшено, приготовленное на молочноьь сыворотке.2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для засева пшена используют культуру второй генерации, выращенную на косяках с соевой агаризованной средой.3. Способ ьпо пп. 1 и 2, отличагощийся тем, что, с целью активации прорастания спор гриба, производят обработку водной суспензии спор перекисью водорода в конечной концентрации 1,57 о в течение 1 мин, а засев осуществляют водной суспензией спор, смытых спшена.