Способ получения ингибитора протеаз

Сокгз Советских Социалистических РеспубликЛо 16,12362/г 31-16) аявлено 311.Х 11.1970 с присоединением заявгииПриоритетОпубликова Комитет по деламиаобретений и открытипри Совете МинистровСССР ДК 615.45:615 З 6: : 615.342,4 (088.8) Бюллетень1 Дата бликова описания 29 Х 1.1973 Авторыгзобретен Л, Б. Полонская, Л. Д. Зуева, В. Рожанская, Л. Л, Борткевич, К,Н, М. Рукина и 3 Всесоюзный научно-исследова промышлеН, Цыганкова, ф. Н, ГМ. Лакин, В, М. ЦареБ. Идельчикельский институт мяснойнности иллер иков,явител г НГИБИТОРА ПРОТЕАЗ ПОСОБ ЧЕ Вьсделение ингггбитора цротеаз.5 Экстракт и промывные воды объединяют идобавлением 5 н. раствора едкого натра устанавливают рН 7,0 и высаливают балластные белки сульфатом аммония из расчета 113 г/л, Осадок отделяют фильтрованием через сукно 10 бета и выбрасывают, а из фильтрата высалцвают иггтибитор-сырец сульфатом аммония из расчета 510 г/л, После отстаивания в течение 10 - 12 час при температуре 5 С надосадочцую жидкость сифонируют, а осадок отделяют 15 фильтрованием на путч-фильтре. Затем осадок, содержащий ингибитор протеаз, растворяют в 3,5 объемах 0,65 н. раствора соляной кислоты, прогревают при 80 С в течение 4 лшн, после чего быстро охлаждают до комнатной 20 температуры и центрифугируют. Белковыйосадок промывают 2 объемами воды, Промывные воды объединяют с основным раствором и добавлением 5 н. раствора едкого натра устанавливают рН 7,5. Ингибитор протеаз выса ливают сульфатом аммония из расчета600 г/л, отделяют фильтрованием на воронке Бюхнера, растворяют в 10 объемах воды, обессоливают методом диализа и лиофилизируют.Выход ццгибитора протеаз активностью 650 - 30 700 ЕД. из 1 кг легких составляет 320 мг,Известен способ получения ингибитора про. теаз путем автолиза измельченного животного сырья, отделения жмыха, экстрагирования, подщелачивания, обработки экстракта сульфатом аммония, нагревания, подщелачивания раствора, фильтрации, высушивация,Однако известный способ не обеспечивает получения ингибитора протеаз в едином технологическом цикле с гепарином и пептоном и, кроме того, ингибитор протеаз недостаточно активен.Для повышения активности ингибитора протеаз с одновременным получением гепарина и пептона из белковых отходов после извлечения ингибитора экстракт после автолиза обрабатывают водой и перед нагреванием осадок обрабатывают 0,65 и, раствором солянкой кислоты, жмых обрабатывают хлористым натрием с последующей обработкой осадка ацетатом калия, далее осадок после извлечения гепарина охлаждают, обрабатывают водой и известным способом выделяют пептон.П р и м е р. 10 кг замороженных легких крупного рогатого скота измельчают на куттере и выдерживают при комнатной температуре в течение 17 час. Затем добавляют 3 объема воды, охлажденной до 8 - 12 и перемешивают в течение 2 час,Легочную ткань (жмых) отделяют ценггрифугировацием, промывают небольшим количеством (около 0,5 объема) воды при рНи используют для выделения гепарина.877159 30 Предмет изобретения Составитель С. ЩеневаТехред 3. Тараненко Корректор Н, Стельмах Редактор К. Шанаурова З,аказ 183817 Изд. Ма 1437 Тираж 467 ПодписноеЦНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССРМосква, Ж, Раушская наб., д. 4(5 Типография, пр. Сапунова, 2 3Жмых после извлечения ингибитора трипсина и промывания экстрагируют 1,5 объемами 0,7 мол. раствора хлористого натра при рН 9 - 9,5 и температуре 55 - 60 в течение 1,5 час. Затем температуру смеси поднимают до 100 С для коагуляции балластных белков, охлаждают до 35 - 40 С и фильтруют. Осадок используют для получения пептона. В полученном фильтрате добавлением 17/о-ного раствора соляной кислоты устанавливают рН 2,5. Выпавший солянокислый осадок гепарина-сырца отделяют центрифугированием и суспендируют в 4 объемах 15%-ного раствора хлористого натра. К суспензии прибавляют 20 о/о-ный раствор хлористого кальция пр рН 9 - 9,5 и температуре 70 - 75 С, смесь нагревают до 95 С, скоагулированный балласт отделяют фильтрованием, а раствор охлаждают до 30 - 35 С и подкисляют соляной кислотой до рН 2,5, Выпавший осадок отделяют центрифугированием. В растворе устанавливают рН 8,2 - 8,3 добавлением 5 и. раствора едкого натра и осаждают гепарин 1,5 объемами этилового спирта,Через 12 - 15 час надосадочную жидкость удаляют сифонированием, а осадок отделяют центрифугированием, растворяют в 10 объемах воды при рН 9 - 9,5 и температуре 60 - 70 С. После этого добавляют к объему смеси 30%-ный раствор перекиси водорода для обесцвечивания, охлаждают до комнатной температуры, фильтруют. К прозрачному фильтрату добавляют до двух молей ацетата калия и уксусной кислоты до рН 5,5, нагревают до 55 - 60 С и быстро охлаждают до 5 - 8 С, после чего выдерживают при этой температуре в течение 10 - 12 час. Выпавший осадок отделяют центрифугированием, растворяют в 10 объемах воды, обрабатывают ионообменной смолой КУв Н-форме в статических условиях и после отделения смолы из раствора осаждают гепарин при рН 6,0 - 6,5 (устанавливают добавлением едкого натра) равным объемом спирта. Выход: 1 кг легких - 11700 ед. с активностью 96 ед/мг. Получение пептона. Остатки легочной ткани после извлечениягепарина быстро охлаждают до 15 - 18 С во 4дой, снижая рН до 6,0 - 6,5. Остаток суспендируют с двумя объемами воды и нагревают до 40 С. В нагретую смесь добавляют фосфорную кислоту с таким расчетом, чтобы началь ное рН смеси было 1,7 - 1,8. В смесь добавляют 8 о/, слизистой оболочки свиных желудков и выдерживают при 45 С в течение 18 - 23 час до полного переваривания ткани. После окончания гидролиза прозрачную жидкость кипя тят с добавлением гидроокиси кальция, устанавливают в растворе рН 8,2 - 8,5. Горячий раствор отделяют от осадка и при 50 С добавляют 1% поджелудочной железы уоойных животных.15 Трипсиновый гидролиз проводят при 50 С,рН 8,2 - 8,5 до полного переваривания белка, что определяется по качественной реакции на белок в присутствии 20/,-ной трихлоруксусной кислоты.20 По окончании протеолиза лизат доводят докипения, затем добавлением фосфорной кислоты устанавливают рН 6,0 - 7,0 и фильтруют в горячем состоянии через сукно бета.Прозрачный раствор высушивают известны ми методами, например на распылительпойсушилкеВыход пептона - 50 г из 1 кг легких. Способ получения ингибитора протеаз путемавтолиза измельченного животного сырья, от деления жмыха, экстрагирования, подщелачивания, обработки экстракта сульфатом аммония, нагревания, подщелачивания раствора, фильтрации, высушивания, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого про дукта с одновременным получением гепаринаи пептона, после автолиза экстракт обрабатывают водой и перед нагреванием осадок обрабатывают 0,65 н. раствором соляной кислоты, жмых обрабатывают хлористым натрием с 45 последующей обработкой осадка ацетатом калия, далее осадок после извлечения гепарина охлаждают, обрабатывают водой и известным способом выделяют пептон.