Способ определения фракций казеина молока

Союз Советских Социалистических РеспубликЗависимое от авт. свидетельства1 п 33 36310/28-1 Заявлено 09,Ч 1.1969 (Л с присоединением заяв риоритетпубликовано 28,1 Ч.1971, Бюллетень15ата опубликования описания 1 Х 11.1971 Комите 1 по делам зобретеиий и открыти при Совете Министров СССРаявител РАКЦИЙ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕН КАЗЕИНА МОфракцийетоном, а казеина,з агара 3 Изобретение относится к области химического анализа молока,Известен способ определения фракций казеина молока, предусматривающий разбавление агара в буфере, содержащем мочевину, 5заливку полученного геля в камеру, растворение казеина в буфере, внесение раствораказеина в гель, установку камеры в кюветус буферным раствором, с последующим проведением процессов электрофореза, фиксации 10и сушки геля, а также окрашивания электрофореграммы, определения количества фракций путем элюирования раствором щелочи иопределения оптической плотности фракций.Цель изобретения - более полное качественное и количественное определение фракцииказеина.Это достигается тем, что разбавление агара,растворение казеина и установление камеры,в кювету осуществляют с использованием боратно-ацетатного буфера,с рН, равным 8,6 -8,9, при этом концентрацию буфера в кюзетеустанавливают в два раза меньше, чем приразбавлении агара.Для приготовления боратно-ацетатного буфера используют ацетата,натрия 47,5 г, бор,ной кислоты 52,56 г и буры 76,28 г на 10 л воды.Перед определениемпоследний высушивают ац и перед его разбавлением удаляют термола. бильные фракции.Процесс электрофореза,проводят,при концентрации белка, равной 1,5 - 2,5 фо, температуре +2 - 8 С в течение 17 - 18 час с использованием платиновых электродов.Используют общий казеин коровьего молока, полученный кислотным переосаждением и высушенный холодным ацетоном.Переносят 45 г Корсаковского агара в широкогорлую колбу на 2 л с меткой, Заливают водой, перемешивают,и оставляют на 3 - 4 час. Воду сливают через марлевые фильтры, находящиеся на горлышке колбы. Через эти же фильтры при помощи воронки заливают воду. Перемешивают и оставляют на ночь. Воду сливают как можно полнее и объем суспензии агара доводят водой до метки 2 л. Гомогенный раствор агара получают нагреванием в кипяченой водяной бане (преимущественно не более 2 час,путем глубокого погружения колбы в воду) .Раствор агара фильтруют на воронке Бюхнера через ватные фильтры (фильтры предварительно,промывают кипяченой водой на воронке). Фильтр собирают, нагревают до 70 - 75 С и отфильтровывают снова. В раствор добавляют мертиолат и хранят в холодильнике.Затем используют электрофоретичеокую камеру, выполненную,из плексигласа,302663 Предмет изобретения Составитель Г, СубботинаТехред Л. Л. Евдонов Корректор Т. А. Абрамова Редактор С. Ежкова Заказ 17805 Изд.736 Тираж 473 ПодписноеЦНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР Москва, Ж.35, Раушская наб д. 45 Типография, пр. Сапунова, 2 В качестве основного буферного раствораиспользуют боратно-ацетатный буфер следующего состава: ацетат,натрия - 43,55 г, борная кислота 52,56 г, бура - 76,28 г на 10 лводы. Все реактивы марки ХЧ, рН такогораствора 8,57. Буферным раствором для геляслужат отфильтрованный раствор 9,я мочевины в боратно-ацетатном буфере с рН 9,4 -9,45,1% -ный гель агара получают, смешивая 10равные части буфера,и 2% агара, рН полученного 1 % -ного раствора агара при 33 - 35 Ссоставляет примерно 8,6.Буферные растворы для электродных кювет получают из раствора 9 я мочевины в 15боратно-ацетатном буфере разбавлением водой 1; 1. рН полученного раствора (обычно9,1) доводят до 8,6 при помощи 1 МНС 1,При 35 - 36 С из 1%-ного раствора агаравыладает мелкий, желтоватый, хлопьевидный 20осадок. Поэтому раствор агара отфильтровывают на воронке Бюхнера через, ватные фильтры и камеру заливают агаром с температурой 32 - 33 С, Толщина геля 4,5 - 5 мм,Через 20 яик устанавливают трафарет для 25образования лунок и оставляют в холодильнике на ночь.На следующий день снимают трафарет инаносят растворы белков в лунки, Для этогоготовится 5%-ный раствор общего казеина 30(высушенного ацетоном) в 9 л мочевине, Белок распворяется быстро и полностью. Переднанесением 0,6 лл 5%-ного раствора казеинасмешивают с 0,4 лл 9 и мочевины в буфере идобавляют 1 ял 2% раствора агара в воде 35(предвар,ительно охлажденного до 40 - 42 С).После тщательного перемешивания растворбелка наносят в лунки, заполняя их до краев.Через 30 лик, поверхность лунок заливают1%-,ным раствором агара,в мочевине,и оставляют на 30 яин. В заключение лунки вторично заплавляют 2%-ным раствором агара,вводе.Для проведения электрофореза в каждуюкювету наливают по 1,5 л буфера в 4,5 м мочевине с рН 8,6 и сразу же включают ток,Электродами служат платиновые проволоки,,источником питания УИП. Электрофорезпроводят при напряжении 4 в/с,и, силе тока75 - 80 мА, температуре 2 - 4 С в течение 5018 час 30 лаан. Концентрация белка 1,4 - 1,5%,количество лунок - 8.Фиксирование, сушка геля, окрашивание иотмывка электрофореграмм,проводятся известным методом, На электрофореграмме обнаруживаются четко разделенных 15 казеиновых фракций,Для количественного определения фракций электрофореграмму разрезают вдоль всех фракций по обеим ее сторонам, затем из этой ленты вырезают каждую фракцию,в отдельности и,измеряют ее длину в ля. Для контроля в пространстве между лентами электрофореграммы в светлом участке вырезают кусочки геля по ширине, равной ширине ленты. Каждую фракцию после измерения их длины измельчают, помещают в пробирке и заливают 2 ял 0,1 Х раствора 1 х 1 аОН, содержащего 0,5 г ЭДТА в 1 л. Содержимое пробирок в процессе экстрагирования (30 лаан) взбалтывают, затем раствор краски переливают в другую пробирку, а кусочки агара снова заливают 2 ил раствора щелочи. Перемешивают и оставляют на 30 иин, Элюат объединяют и измеряют оптическую плотность на СФпри 590 млк. По сумме оптических плотностей лроизводят,расчет процентного содеркания каждой из 15 фракций казвина. 1. Способ определения фракций казеина молока, предусматривающий разбавление агара в буфере, содержащем мочевину, заливку полученного геля,в камеру, растворение казенна в буфере, внесение раствора казеина в гель, установку камеры в кювету с буферным раствором, с последующим проведением процессов электрофореза, фиксации и сушки геля, и также окрашивания электрофореграммы, определения количества фракций путем элюирования раствором щелочи и определения оптической плотности фракций, отличающийся тем, что, с целью более полного качественного и количественного определения фракций казеина, используют боратно-ацетатный буфер с рН, равным 8,6 - 8,9, при этом концентрацию буфера в кювете устанавливают в два раза меньше, чем при разбавлении агара.2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для приготовления боратно-ацетатного буфера используют ацетата натрия 47,5 г, борной кислоты 52,56 г и буры 76,28 г на 10 л воды.3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что перед определением фракций казеина, последний высушивают ацетоном, а из агара перед его разоавлекием удаляют термолабильные фракции,4, Способ,по п, 1, отличающийся тем, что процесс электрофореза,проводят при концентрации белка, равной 1,5 - 2,5%, температуре +2 - 8 С в течение 17 - 18 час с использованием платиновых электродов,