241620

Авто изоб ВСЕСОБ 2."г Луног 7 гй.1 О. Г. Беленький, Всесоюзный н Б. Полонская, Н. Н. и В. И. Чугаринов чно-исследовательский промышленностиния а Заявитель титут мяс СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНЫХ И ГОРМОНАЛЪНЬХ ПРЕПАРАТОВэкстракцию, выказанные спосоости, комплекс рибонуклеазы и МЪсЗ Хзвеспн г гггособы:получения ферментов г поджелудочной железы кр пного рогатого 1 ск та, вклюнающие измельчание,саливание и фильтрование. Убы предусзгатривают, в часпнное получение хихготрипсина,дезоксирибонуклеазы.По предлагаехговгу способу, в отличие отизвестных, зкстракцию производят ацетапнымбуферным раствором при рН 3,5 в прнсутствии 10%-ного хлористого натрия и температуре 5 - 8 С. Это позвоняет в одежном технологическом цикле получить рибонуклеазу, дезозссирибонуклеазу, химотрипсич, химотрипсин В, липокаип, ингибитор трипсина, карбоисипептидазу, и наряду с нихги инсулин.П р и м е р, Зазгороженню поджелудочнуюжелезу измельчают и суспендируют в ацетатном буфернсег растворе при рН 3,5 в присутствии 10%-ного раствора хлористого натрия 20в соотношении 1: 2. Эосстракцию проводят15 - 16 час при 2 С и псриодическохг помешпвании, добавляют кристаллический сульфатаммония до концентрации 26 гг,г и через часотделяют экстракт. Жмых повторно эКстрагируют в течение 2 час и затем выдесляют инсулин известным методом, Из объединенныхэкстрактов,добавлением сульфата аммониядо концентрации 110 г.г осаждают первыйбелковый высол, кото "ьгй отделяют после ст стаивания в течение 1 О - 12 час при 5 - 8 С и используют для выделения липокаина. Фильтрат насыщают сульфатом аммония до конценграции 220 г/,г и вновь отделяют осадок, содержащий химотрипсин В, дезоксирибонуклеазукарбоксипептидазу и липокаин. В фильпрат,добавляют сульфат аммония при 5 С до концентрации 450 г/.г и отделяют осадок, содержащий липокаин, хихготрипсин, трипсин и ингибитор трипсина. Добавлением сульфата аммония,до концентрации 560 г/.г при 20 С выделяют осадок, содержащий рибонуклеазу. Белковые осадки, после разлинных стадий осаждения подвергают,дальнейшей очистке и,кристаллизации ферментов,8 - 10 кг высушенного осадка, полученного после второго осаждения из экстракта 1000 кг поджелудочной ез (220 г/.г лльфата аммония) и очищенного от слизистых вещеспв, суслендируют,в 4 объемах воды, добавляют 0,25 от оощего объема 1 М ацетапного буферного раствора (рН 4,5), перемешивают 1 час и, добавляют 0,2 объема насыщенного распвора сульфата аммония. Полученный осадек отделяют фильтрованием, пром,гвают раствором, содержащим 4 объема 20",с-ного раствора сульфата аммония и 1 объемЛ ацетатного буферного распвора (рН 4), и тжимают. Дальнейшая очистка и кристаллизация химогрипсина осуществляются извесгным спосо3бом. Промывные 1 воды объединяют с фидьтратом, доводят рН до, 5,5 и добавляют сульфат аммо 1 ния до концентрации, 550 г/л. Полученный осадок распворяют в 5 объеьмах 2,5%оного раствора сульфата магния,при рН 4, нагревают при перемешивании в течение 10 мин до 45 С и охлаждают до 10 С. Выпавш,ий осадо 1 к отфильтровывают, трижды повторяют описанную ваше обработку для подново извлечения карбоксипептидазы и дезоксирибонуклеазы и оставляют для получения липокаина. Фильтрат разбавляют в 10 раз дистиллированной водой и, собирают выделившийся осадочек для получения карбоксипептидазы извеспным способом. К,фильтрату добавляют сульфат аммония до концентрации 200 г/л и отделяют осадок для выделения известным ыетодом дезоисирибону 1 клеазы, Об ьединенный осадокпосле перьвого и второго осаждения, остановленный для выделения липокаина, су 1 епендируют в восьмикратном объеме 0,12 н. серной,кислоты и перемешивают 6 час. Нерастворившийся остаток суоспендируют в восьмикрапном объеме дистиллированной воды в течение 3 час, отфильтровывают и отбрасывают нерастворившуюся часть. Объединенные фильт 1 раты нодвергают электродиализу через целофановую мембрану в течени 1 е 6 час,противев дистиллированной воды. К образовавшейся белковой суспензии добавляют треп ел или кизелыгур (10 г/л), перемешивают 30 мин и. фильтруют. К прозрач 1 ному охлажденному до 5 С,фильтрату добавляют 0,5 объема спирта, 1 подкисляют до рН 2 - 2,5 и отстаивают 3 - 5 час.К,профильтрованному раствору медленно ври перемешивании добавляют 5 объемов спирта и опстаивают сутки при 0 - 5 С, вновь фильтруют и добавляют еще 5 объемов спирта, Осадок, образовавшийся после выдерживаяния смеси в течение суток при 0 - 5 С, опфильтро- вьпвают и сушат при температуре не выше 40 С.Выделение химотрипсина из осадка помысле третьего осаждения (450 г/л сульфата аммония) осуществляют извеспным способом, а фильпрат после,кристаллизации химотрипсина подкисляют,до рН 3 и добавляют сульфат аммония до,концентрации 320 г/л. Осадочек отделяют, распворяют в дистиллированной воде (1: 3), добавляют 2 объема (к веласу осадка) насыщенного раствора сульфата аммония и помысле отстаивания при 5 С опфильтровьпвают. К фильтрату добавляют равный объем насыщенново распвора сульфата аммония, перемешивают, отстаивают 5 - 8 час и опделяют осадок, который затем растворяют 1 в дистиллиро, - ваоной воде (1: 2), добавляют хлористый кальций до конценпрации 25 г/лдоводят рН до 7,8 - 8 добавлением видрата окиси, кальция и выдерживают распвор сутки при температуоре не выше 5 С. Затем,добавляют 5 н. серную кислоту до, рН 2,5 - 3 и оксалат аммония до полного осаждения ионов кальция, филыпруют и, добавляют к фильтрату сульфат магния до,концентрации 300 г/л. Белковый55 б 0 65 Способ получения ферментных и. гормональных препаратов из поджелудочной железы крунного рогатого окота, включающий измельчение, экстракцию, высаливание и, фильтрование, отличающийся тем, что, с целью получения,в одном тежнологическом цикле рибонуоклеазы, дезаксирибонуклеазы, химотрипсина, химотрипсина В, карбоксипептидазы, ли,- покаина, ингибитора трипсина и наряду с ни. ми иинсулина, акспракцию проводят ацетатньпм буферным раствором при рН 3,5 в присутст,вии 10%-ного хлористого,натрия и температуре 5 - 8 С. 4с о,Госадок отстаивают в течение суток при 5 С,отделяют и растворяют в,миниыальном количестве,боратного буферного раствора при0 С. После очистки от слизистых вещеспв доводят рН до 7,6 - 7,8, добавляют равныйобъем насыщенного раствора сульфата магния, оставляют на 48 час при 0 С, кристалличеекий осадок отделяют фильтрацией и подсуипивают. В фильтрат, полученный после от 10 деления трипсина, добавляют трихлоруксусгпую кислоту до концентрации 5/о и р не менее 3,5, отделяют выделивший 1 ся осадок ирастворяют его в 0,1 н, серной кислоте.К раствору при рН 1 добавляют трихлору 1 к 15 су 1 сную кислоту до концентрации 2,5 о/о, нагревают до 70 С и выдерживают при перемешивании 1 - 2 час, После охлаждения и, фильт 1 рования к фидьтрату добавляют трихлоруксусную кислоту до 5/,-ной,концентрации, и,про 20 гревают 20 мин при 70 С. Выпадавший осадокотфидьтровывают, раствор охлаждают,и отфильтрованный осадок пять раз суопендируютв,пятикратном объеме ацетона и подсушивают, получая аморфный препарат ингибитора25 трипсина,Осадок после следующего осаждения(560 г/ г сульфата аммония) распворяют в10 чкратном количестве дистиллированной воды, доводят рН до 3,5 и смешивают с равным30 объемом насыщенного раствора сульфата аммония, Осадок отбрасывают, а в фильтрате,доводят рН,до 4,2 и добавляют сульфат аммония,до концентрации 150 г/л. Белковыйосадок отфильтровывают, растворяют в35 5 зкратном количестве 20/о-,ного распвора сульфата аммония, доводят рН до 3 - 3,5, прогревают 5 мин при, 95 - 97 С, быстро охлаждаютдо комнатной температу ры и,перемешивают втечение 2 час. Осадок отбрасьпвают, а,в40 фильтрате устанавливают рН 4,2 и добавляютсульфат аммония до степени насыщения 0,8.Осадок отфильтровывают, распворяют в равном объеме дистиллированной воды фильтруют с кизельгуром и,кристаллизуют рибо 45 нуклеазу путем добавления насыщенного раствора сульфата аммония до появления слабоймути. После этого рН доводят,до 4,6 добавле,нием едкого натра (1 н.) и через супки отделяют выпавшие кристаллы рибонуклеазы.50Предмет изобретения