Способ получения ферментных препаратовлизоцилов

О П И С А Н И Е 22 О 92 ОИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз Советскиа Социалистикескик Республик: ,а ЕсФ" МГ Зависимое от авт. свидетельстваЗаявлено 07.Е 1967 (ЛЪ 1124352/28-13)с присоединением заявкиПриоритетОпубликовано 01 Х 11.1968. Бюллетень21Дата опубликования описания 7.Х.19 б 8 5 Г 1 К С 121 Комйтет по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССРАвторы изобретения И. А. Черкасов и Н. А. Кравченко Институт органической химии имени Н. Д. ЗелинскогоЗаявитель СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ фЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ ЛИЗОЦИМОВИзвестен способ получения ферментных препаратов лизоцимов из содержащего их сырья путем приготовления из этого сырья солевого раствора, содержащего хлористый натрий в концентрации от 0,5 до 1,0 и имеющего рН от 5 до 5,5, адсорбции лизоцимов из полученного раствора на хитине, промывки хитина солевым раствором для удаления несорбирующихся примесей, содержащихся в исходном сырье, с последующей десорбцией лизоцимов дистиллированной водой.Полученный известным способом лизоцим представляет собой гомогенный белковый препарат, содержащий примеси около 5 с 7 с хлористого натрия и следы углеводов.Для освобождения лизоцима от этих примесей проводят сорбцию лизоцима из раствора, полученного после первичной сорбции, причем в этот раствор добавляют фосфаты натрия или калия, доводя рН до 8. Примеси удаляют водой, а лизоцим затем десорбируют 0,5 - 1,0% -ной уксусной кислотой,Для упрощения процесса получения очищенных ферментных препаратов лизоцимов согласно, предлагаемому способу хитин предварительно модифицируют путем обработки его разбавленной азотистой кислотой при температуре, предпочтительно равной от 2 до 4, и рН раствора от 2 до 3 С. По предлагасмому способу солевой раствор,содержащий лизоцимы, следует приготоьлять путем смешивания исходного сь:рья с бикарбснатом натрия или со смесью бикарбопата и карбоната аммония до получения раствора с концентрацией солей ог 05 до 1,01 о и рН 7,9 - 8,4.Кроме того, целесообразно хитин после промывки соленым раствором промывать дистил лированной водой для удаления солсй, послечего лизоцим дссорбировать 3 - 5,-ной уксуснои кислотой.Предлагаемый способ заключается в следующем. Получаемый из природного сырья 15 известным способом хитин содержит свободные аминогрулпыпридающие ему свойства анионоооменника и снижающие его специфичность как сорбента лизоцимов.Для устранения этих свойств целесобраз но обработать такой хитин азотистой кислотой, в результате чего аминогруппы заменяются гидроксильными группами, не обладающими ионообменными свойствами.Модификацию хитина ведут в 0,3 - 05%- 25 ном растворе азотистой кислоты при 2 - 4 С.По механическим и физико-химическимсвойствам полученный при этом хитин не отличается от исходного, 1 г модифицированного хитина со средним диаметром частиц от 150 30 до 200,ик сорбируст около 15 иг лизоцпма,Заказ 2830/ Тираж 530 Подписное ЦНИИПИ Комитета по делам нзоорстеипй и открытий при Совете Министров СССР Москва, Центр, пр, Серова, д. 4 Типография, пр. Сапунова, 2 3Выделение лизоцима из содержащего его сырья с помощью полученного вышеуказанным способом сорбента проводят следующим способом. В исходный раствор (сок, экстракт, биологическую жидкость) вносят бикарбонат натрия (или смесь бикарбоната и карбоната аммония) до концентрации 0,5 - 1,0 о/, и устанавливают рН в интервале от 7,9 до 8,4.Полученный раствор пропускают через слой хитина. Лизоцим при этом полностью сорбируется на хитине, Несорбирующиеся,примеси, содержащиеся в исходном сырье, удаляют путем промывания сорбента раствором бикарбо. ната натрия (или смеси бикарбоната и карбоната аммония) с теми же значениями рН и концентрации.После этого сорбент промывают водой, удаляя таким образом соли. Лизоцим десорбируют 3 - 5% -ной уксусной кислотой. После отмывки его от уксусной кислоты дистиллированной водой хитин может быть использован для очередной операции извлечения лизоцима. Прим ер 1, В качестве исходного сырья использовали белок одного куриного яйца (25 мл). Его разбавляли до 250 мл 1%-ным раствором ХаНСОа. Полученный раствор пропускали через колонну (2 ХЗО см) с хитином, диаметр частиц которого составлял от 150 до 200 мк (в колонку предварительно промывали 1/о-ным раствором МаНСОа), Отмыли 1%-ным раствором Ь 3 аНСО,; контроль за отмывкой проводили путем измерения оптической плотности вытекающего из колонки раствора при 280 ммк на спектрофотометре СФ.Затем колонку промывали водой до удаления КаНСОа, контролируя отмывку, пробой на окрашивание пламени газовой горелки. Лизоцим десорбировали 5/о -ным раствором СН,СООН и леофильно высушивали. Выход лизоцима составил около 120 мг.Ферментативная активность его совпадала с активностью стандартного препарата лизоцима, полученного методом прямой кристаллизации. 15 20 25 Зо 35 40 45 П р и м с р 2. В качестве исходного сырья использовали сок (около 400 мл), отжатый из 1 кг неочищенной репы. К соку добавляли сухой КаНСОа до концентрации 1 о/о и центрифугировали для удаления механических частиц. Затем из этого очищенного раствора выделяли лизоцим так же, как в примере 1. Выход лизоцима составил около 10 мг, ферментативная активность его равнялась 60% от ак тивности лизоцима из белка куриных яиц в расчете на единицу 1 веса лиофильно сухих препаратов. Предмет изобретения1, Способ получения ферментных препаратов лизоцимов из содержащего их сырья путем ,приготовления из этого сырья солевого раствора, адсорбции лизоцимов из полученного раствора на хитине, промывки хитина солевым раствором для удаления несорбирующих ся примесей, содержащихся в исходном сырье, с последующей десорбцией лизоцимов, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса получения очищенных ферментных,препаратов, хитин предварительно модифицируют путем обработки его разбавленной азотистой кислотой.2, Способ по п. 1, отличающийся тем, что модификацию хитина проводят при температуре от 2 до 4 и рН раствора от 2 до 3 С.3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что солевой раствор, содержащий лизоцимы, приготавливают путем смешивания исходного сырья с бикарбонатом натрия или со смесью бикарбоната и карбоната аммония до получения их концентрации 0,5 - 1 в/, и рН раствора 7,9 - 8,4, а в качестве солевого раствора, применяемого для промывки хитина, используюг 1 в/о-ный раствор бикарбоната и карбоната аммония.4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что хитин после промывки солевым раствором промывают дистиллированной водой, а десорбцию лизоцимов проводят 3 - 5%-ной уксусной кислотой,