Способ определения сенсибилизации лейкоцитов

( )ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ная ИБИожет тике ретет ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОВЕДОМСТВО СССРГОСПАТЕНТ СССР(71) Институт проблем криобиологии иомедицины АН УССР(56) Авторское свидетельство СССРМ 1359743, кл, 0 01 М 33/48, 1987.,(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СЕНСЛИЗАЦИИ ЛЕйКОЦИтОВ, (57) Использование: изобретение мбыть использовано в иммунодиагносаллергических достояний, Цель изоб Изобретение относится к. медицине, вчастности иммунодиагностике аллергических Состояний.Наиболее близким к заявляемому является способ сенсибилизации лейкоцитов,согласно которому образцы помещают впробирки, добавляют аллерген на 570-номрастворе цитрата натрия, инкубируют при450 С, готовят мазки и подсчитьвают содержание измененных нейтрофилов,Недостатком способа является невысокая чувствительность; обусловленная тем,что клетки, наиболее поврежденные антигеном, разрушаются в процессе приготовления мазков.Целью изобретения является повышение чувствительно,ти способа.Поставленная цель достигается тем,.ч о, в способе ог.зеделения сенсибилизации лейкоцитов, вк 1 ючающем их инкубациюс антигенами; приготовление препарата иоценку результатов, инкубацию проводят визотонической среде на предметном стекле,. ния - повышение чувствительности способа. Сущность изобретения: образцы крови с антигеном инкубируют на стекле в изотонической среде, высушивают и обрабатывают . реактивом Дунгера 3-4 мин. Затем препарат окрашивают азуром и исследуют. Положи-. тельный эффект: условия проведения сйособа исключают приготовление мазка, .приводящее к раздавливанию наиболее измененных под влиянием антигена клеток, рассматривается наиболее активная популяция лейкоцитов" прилипающие клетки, чувствительность способа возрастает в 10 и более раз.1 после чего неприлипшие клетки смывают и высушенный препарат обрабатывают реактивом Дунгера в течение 3-4 мин, а оценкуЯ сенсибилизации осуществляют по изменению размера сегментоядерных лейкоцитов по сравнению с контролем, : . Способ осуществляется следующим об-; ф разом.: Сд5 мл венозной крови набирают в сили-р конированную пробирку; содеркащую гепаринизрасчета 5 ед а 1 млкрови Пробирку помещают в термостат и выдерживают под . . углом 60.в течение 60 мин при 37 С. На.чистые обезжиренные стекла наносят рамку из расплавленного парафина, ограйичиваю-, -д щую квадрат 2 х 2 см. На подготовленное ложе наносят 0,4 мл среды 199, рабочую дозу коммерческого аллергена (0,0025, 0,005, О,001) и 0,1 мл плазмы, обогащенной лейкоцитами. На стекло, контрольного препарата наносят соеду 199 и плазму в таком же количестве;Инкубационную смесь размешивают покачиванием на стекле или продуванием воздуха из пипетки, соединенной с резиновой грушей, Стекла. помещают в эксикатор, на дно которого наливают небольшой объем воды для создания влажной камеры, закрывают и помещают на 60 мин в термостат при 37. Через час препараты сливают, смывают неприлипшие клетки и тромбоциты теплой средой 199 (рН 7,2), содеркащей 5 ед гепарина в 1 мл. Препараты . высушивают на воздухе, после чего на поверхность высушенных прилипших клеток наносят реактив Дунгера и выдерживают 3-4 мин, Препараты быстро сливают, высушивают в.вертикальном положении, Окрашинание препарата водным раствором 2 О-ного азура осуществляют путем погружения его в краситель на 1-2 с, после чего препарат быстро ополаскивают водой, После высушивания препаратов производят их иммерсионную микроскопию, сопоставляя размеры сегментоядерных лейкоцитов контрольного и опытного образцов.П р и м е р. Больной Рдиагноз: облитерирующий эндартериит левой нижней конечности, трофические. язвы, микробная экзема. Проведено определение сенсибилизации лейкоцитов крови к стрептококковому и стафилококковому аллергенам, 5 мл крови, полученной иэ вены стандартным методом, помещали в силиконированную пробирку, содержащую 25 ед гепарина. На поверхность чистых и обезжиренных предметных стекол наносили рамку из парафина, ограничивающую квадрат 2 х 2 см, На подготовленное ложе контрольного препарата наносили 0,4 мл среды 199 и 0,1 мл плазмы. Опытные препараты готовили путем добавления к среде коммерческих аллергенов гемолитического стафилококка и стрептококка в дозах 0,0025, 0,005 и 0,01, после чего добавляли по 0,1 мл плазмы. Смесь размешивали покачиванием стекол, затем помещали в эксикатор, содержавший на дне небольшой объем воды, эксикатор закрывали и помещали н термостат. Инкубацию осуществляли 60 мин при 37 С. После инкубации препараты сливали, смывали .неприлипшие клетки теплой средой 199 (рН 7,2) физраствором, содержащим гепарин (5 ед/мл). Препараты высушивали, наносили реактив Дунгера на 3 мин, после чего высушивали в вертикальном положении. Докрашивание сухих препаратов осуществлялиФормула изобретения Способ определения сенсибилизации лейкоцитов, включающий их инкубацию с анти геном, приготовление препарата и оценку результатов, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения чувствительности способа, инкубацию проводят в изотонической среде на предметном стекле, после чего неприлипшие клетки смывают и 50 высушенный препарат обрабатывают реактивом Дункера в течение 3-4 мин, а оценку сенсибилизации осуществляют по изменению размера сегментоядерных лейкоцитов 55 по сравнению с контролем,погружением в 2 О-ный водный раствор азура. Препараты смывали, высушивали и исследовали под микроскопом.В контрольных препаратах клетки5 не изменены, имели сохранные ядра,четкую аэурофильную зернистость, сохранныемембраны,В опытных препаратах уже в дозе антигенов 0,0025 мл были клетки бесформен 10 ные, увеличены в размерах, ядра неопределялись.Результат оценен как резко положительный (100 О 2 измененных клеток).При обследовании этого больного спо 15 собом по прототипу в контрольном препарате отмечалось 10 О поврежденных клеток, вопытном препарате, содержащем аллергенстрептококка, - 15 О, стафилококка - 34 2.Индекс сенсибилизации лейкоцитов для20 15 -10стрептококкового аллергена = 0,05,10034 - 10для отафилококкового - = 0,24:100Таким образом при обследовании спо 25 сабом по прототипу сенсибилизация лейкоцитов к стрептококковому аллергенуничтокна (индекс 0,05), к стафилококконому - умеренная (индекс 0,24).При обследовании заявляемым спосо 30 .бом наблюдается повреждение 100 ф клеток при дозе в 8 раз меньшей, чем впрототипе, т.е. чувствительность заявляемого способа более чем на порядок превышает чувствительность способа по35 прототипу.Высокий положительный эффект заявляемого способа обусловлен тем, что исследование проводится с популяцией наиболеефункционально активных клеток - прилипа 40 ющих,