Способ определения т-лимфоцитов у детей

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИК 19)9 ИЯ; П ЗОБ РЕТ ВТОРС КОМУ В(56) Авторск 1365916, кл,601 М 33/ юл, В 4инскийтитутьман ие саид сударственный меП, Черданцевтельство СССР.Я 3, 1989.ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯПРИ ГКНТ СССР Изобретение относится к медицине именно к иммунологии.Известен способ определения Т-лимфоцитов, заключающийся в том, что путем выделения лимфоцитов из периферической крови и облучения их монохроматическим лазерным излучением в течение 2 мин повышается точность способа розеткообразова ния, Однако для осуществления способа необходим источник лазерного излучения, относящийся к дорогостоящим приборам. Точность способа повышается у здоровых доноров, у больных же детей стимулирую. щий эффект не достигается. Индекс стимуляции Т-лимфоцитов при этом достигает 36,7 + 6,6%. Это свидетельствуетотом, что лазерное излучение не обладает однозначной стимулирующей активностью у здоровых и больных лиц,Цель изобретения - повышение чувствительности способа. 51)5 А 61 М 1/36//О 01 й 33/5 иммунологии. Целью изобретения является повышение чувствительности способа определения Т-лимфоцитов у детей. Для реакции розеткообраэования используют выделенные на градиенте плотности фиколл-верографин лимфоциты ребенка, на которые воздействуют постоянным магнитным полем напряженностью 33 + 5 мТл с последующей постановкой реакции розеткообразования. По сравнению с про- тотипом увеличивается чувствительность способа для Е-РОК в 1,3 раза, для Етр-РОК- хелперов в 2 раза. ют следующим обраИз венозной гепаринизированной крови донора центрифугированием в градиенте плотности фиколл-верографии (о - 1077) выделяют лимфовидные клетки. Отмывают их двукратно от сывороточных белков средой 199, количество лимфоцитов доводят до концентрации 2-2,5 х 10 клеток, жизнеспособ 6ность их определяют 0.1 раствором трипанового синего. К 0,2 мл взвеси лимфоцитов в среде 199 добавляют 0,2 мл 2 взвеси зритроцитов барана. Полученную смесь инкубируют при 37 С 10 мин, затем центрифугируют при 1000 об/мин 5 мин ив последующем выдерживают в холодильнике при 4 С 18-20 ч, Затем подсчитывают количество лимфоцитов, присоединивших эритроциты барана от 3 до 6 /Т 1/ от 7 до 11 /Т 2/ и от 11 и более /ТЗ/. В другую пробирку с 0,2 мл взвеси лимфоцитов добавляют раствор теофил лина 5 мг/мл,Способ осуществляэом.1777894 3-й пробирки(контроль без ПМ Г) добавляли 0,2 мл 2% взвеси эритроцитов барана. Суспензию 2-й и 4-й пробирок (опыт) подвергали воздействию ПМП с напряженностью инкубируют в термостате в течение часа, отмывают затем средой 199, В последующем добавляют 0,2 мл 2% взвеси эритроцитов барана и повторяют операции как в случае с 1-й пробиркой, подсчитывают количество Етр-РОК. Эти исследования принимают за контроль, Параллельно в 2 другие пробирки добавляют 0,2 мл суспензии лимфоцитов в концентрации 2 - 2,5 мл х 10. клеток и подвергают воздействию постоянного магнитного поля (ПМП) =33 5 мТл в . течение 20 мин. В одну из пробирок добавляют раствор теофиллина 5 мг/мл, инкубируют при 370 С - ". ч, отмывают лимфоциты средой 199. Затем в обе пробирки добавляют по 0,2 мл 2% взвеси эритроцитов барана.Полученные взвеси инкубируют при 37 С 10 мин, центрифугируют при 1000 об/мин 5 мин и выдерживают в холодильнике при 4 С 18 - 20 ч. Затем производят подсчет Е-РОК на 100 клеток и Етр-РОК на 100 клеток. Данное исследование принимают за опыт, и по количеству розеткообразующих клеток,определяют количество Т-лимфоцитов.Учет результатов производят по сравнению опытного и контрольного исследования.П р и м е р 1, Ребенок К., 1 год 10 мес., поступил с жалобами на повышение температуры до 38 С: заложенность носа, на сильный кашель жалобы. Болен второй день, Обьективно: отмечено состояние средней тяжести, наличие катарального синдрома носоглотки, Со стороны других органов и систем патологии не выявлено.Анамнез отягощен токсикозом беременности у матери, перенесенными 4 раза остры. ми респираторными заболеваниями,бронхитом. Выделили лимфоидные клетки, из гепаринизированной венозной крови в градиенте плотности 1,077 фиколл-верографина. Получили лимфоидные клетки - 2-2,5 млн, мл в 1 мл среды 199, Разлили полученную суспензию по 0,2 мл в 4 пробирки К. 1, 2, 3, 4, В третью и четвертую пробирки добавили раствор теофиллина до концентрации 5 мг/мл и инкубировали в течение 1-го ч при 37 С. Затем отмывали лимфоциты от теофиллина средой,199. К суспензии 1-й и поля на поверхности ЭЭ й 5 мТл, время 20 мин, затем к лимфоцитам добавляли 0,2 мл 2% взвеси эритроцитов барана, В последующем 4 пробирки со смесью клеток инкубировали при 370 С в течение 10 мин, центрифугировали при 1000 об/мин 5 мин н инкубировали при 4 С в течение 18 ч. В контрольной пробирке содержание Т 1-13%, Т 2-7%, Тз%.Т 0 бщ. - 24 % Т 1 - количество прикрепившихся эритроцитов от 3 до 6, Т 2- от бдо 10, Тз -свыше 10 морула. Етр- РОК 51015(теофиллинрезистентных лимфоцитов) е контроле - 12%. В опытных пробирках: Т 1- 24%, Т 2-4%, Тз - 10%, Тобщ.-48%. Етр - РОК%, Индекс сдвига Е-РОК (Т-лимфочитов) 100%. Следовательно количество как попу 20 ляции Т-лимфоцитов, так и субпопуляции Етр-РОК; что свидетельствует о повышении чувствительности способа розеткообразования благодаря воздейсТвия ПМП на состоякие мембраны лимфоцитов, их рецепторного аппарата. Увеличивается в 2 раза с лишним содержание Т-высокоаффинных клеток - Тз.По сравнению с прототипом увеличивается чувствительность способа в отношении выявления Т-лимфоцитов их авидности по прототипу, %: Т 1 - 2 б,4 ": 2,1, Т 2 - 5,8 + 1,04;Тз,2 " 1,8; Е-РОК,38,2 ": 3,2, при воздействии ПМП Т 1 - 24,9 + 1,7;Т 2 - 9,3 1,3; Тз - 21,3 + 2,9, Е-РОК - 55,9 + 3,12,25 30 35 Формула изобретения Способ определения Т-лимфоцитов у детей путем забора крови, выделения лимфоцитов, инкубации их с эритроцитами барана, подсчета розеткообразующих клеток, и по их количеству определяют содержание Т-лимфоцитов,отл и чаю щи йся тем, что, с целью повышения чувствительности способа перед инкубацией с эритроцитами лимфоциты подвергают воздействию постоянным магнитным полем напряженностью 33 + 5 мТл в течение 20 мин. Составитель А.КусельманТехред М,Моргентал Корректор С,Лисина Редактор М.Егорова Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 Заказ 4151 . Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5