Способ разделения гепатоцитов

(51) 5 С 12 Б 5/( ГОСУД АРС 1 Б ПО ИЗОБРЕТ ПРИ ННТ С НЫЙ Е(О(т(ИТЕТЯтл( И ОТНРЫТИЯ ЗОБР ЕЛЕН АН я оВ 7.06,92,Бюл. Е( 21272263/149,06.87исти тут тт ро бгте. ккединицы АН .т( Г.Р(57) ПОСОН РАЗЦГт 11.1(И.т( зобретнте оттост огитя тгмллттттф) Р я жттзттеспособцых рсждецттт тх, Цельо ГЕЕ(ГЖЦИТО тся к биотехтол делени нособ гепатоцитонэобретеци т по мМ Изобретецие относится к биотехнологии, а именно к способам отделения жизнеспособных гепатоцитон от поврежденных.Целью изобретения является увеличение выхола жизнеспособных клеток за счет разделения клеток в изотонической сахарозной среде при следуюп(ем содержании компонентов; 250 мМ сахарозы, 5 мМ КС 1, 0,4 мМ КНРО(,1,6 мМ Ба НРО, 0,8 мМ МДС 1, 1,2 СаС 1 , 1 Х альбумина.П р и м ер 1. ПерФузито печени крыс-самцов массой 200-250 г проводили т.п з 1 ц, Лття этого брюшную полость анестеэированного тиопенталом животного вскрывали, вводили инъекционцую иглу в воротную вену и закрепляли лигатурой, а верхпото полую подсекали в месте ответвления правой ттсчечной вены для оттока с.является увеличеттнс тттяхс па жизнеспособных клеток, Суспензпю генатоцитов в иэототтлтческот сахарозе, соле ржащуто О, 8 мМ МС 1., 5 т т КС 1,1 6 мМ Ел(а ЕЕРОа л От 4 мМ КН г (От ф1,;. мМ СаС 1 ц 1 А ал ьбумина, це цтрттфуг руют гтрн 50 ян течение 4 мнн.При этом суспецзин клеток разделяется на 2 тттракции: нижнктю, болеетемтуо, и нерхнтото, светлую, Фракцииразделяют, ттосле чего счсгтеттттнр ллтон соленом расттторе и оттрс дгляют жизнеспособность, Ицт:ткттсые клетт;и содержатся н нижней, более тетией Фракции. 1 табл,.перт 1 тузата, На первом этапе печень отмывали от крови со скоростью 25- 35 мл/ттин раствором, содержащим 40 мМ БаС 1, 5 мМ КСЕ, 3 мМ Е(аЕ(СЪ, 27 мМ лимонцокислого натрия, который насыщали газовой смесью 95/ О и 53 СО до рН 7,4 в течсцнс 10 мнн при 37 С со скоростью 25-35 мл/мтттт. На втором этапе перфузию проводили с той же скоростью в течение 20-30 мин. На этом этапе в среду вводили ЭДТА до конечной концентрации 2 тт.1, После окончания перфузии гтечень извлекали из брющной полости, быстро охлаждали до 0 С и измельчалн ножцнна.тн в среде, содержащей 250 мМ сахарозы, 5 мМ КС 1, 1,6 мМ г(аЕ(РО , 0,4 мМ КН. РО+, 0,8 мМ МяС 1 , 1,2 мМ СаГ 1 , 1 Ж сит- бумина (рН 7,4). Кусочки ткаци подвергали вибрацтги н охлажлеттттой саха- розно-солевой среде с частотой 50 Гц(количество жизнеспособных клеток)1007 общее количество клеток 25 и 19,6 Х по известному способу,.т.е вьппе на 443 по предлагаемомуспособу,Жцэнеэкю /с1 ущ, нмоль ЮсФ, нмольО /О кл/мин О/1 О кл/мин Фракция способность,22,74 2, 1 1,33+01 Нижняя 10 93 + 2Верхняя 5 Зл17,74:2,2 11,2 И 0,7 Составитель Л. СабуроваТехред Л,Кравчук Корректор В,Кабаний Редактор Л, Коцдрахица Заказ 1773/ДСИ Тираж 367 ПодписноеВНИИПИ Государсч венного комитета по изобретениям и открытиям прц ГЕНТ СССР 3035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5 Ф ееПроизводственно-издательский комбинат Патент , г.ужгород, ул, Гагарина,10 3 1510356 в течение 60 с с помощью устройства, электродвигатель которого приводит в возвратно-поступательное движение пестик. Полученную после вибрации суспенэию клеток фильтровали через нейлон и центрифугировалц при 50 8 в течение ц мцц. При этом суспензия клеток разделилась на 2 фракции: нижнюю, более темную, и верхнюю, свет- О лую, Фракции разделяли, после чего суспендировали в солевом растворе, содержащем 40 мМ НаС 1, 5 мМ КС 1, 08 мМ МВБО+ 1 6 мМ.Баа 11 РО 0 А мИ КНРО 4, 25 мМ Иа 11 СО,мИ СаС 1 (рй 7,4).Полученные после промывки клетки исследовали. Жизнеспособность определяли методом окрашивания трипановым синим, скорость эндогецного ды хания (Ч ) в отсутствие и присут- щ Формула изобретения 30 Способ разделения гепатоццтов путем дезагрегации печени, фракционирования полученных клеток в среде разделения на две фракции, отделения35 нижней фракции .с последующей очисткой гепатоццтов промыванием н соленом 4ствиЕ. сукцицята (5 мМ) определяли полярографически, результаты представлены в таблице.11 з таблицы видно, что в нижней фракции находятся интактные клетки (жизнеспособность 933), обладающие высоким зцдогенным дыханием; Зндогецное дыхание клеток нижнего слоя слабо стимулируется сукцинатом, в норме не проникающим через плаэматическую мембрану.В верхнем слое большинство клеток прокращивается трипацовым сипим, эцдогеиное дыхание в 8 раз ниже, чем в клетках .нижней фракции. Сукцицат стимулирует дыхание более чем в 11 раз.Выход жизнеспособных клеток из всей печени в процентах составил28,37. по предлагаемому способу растворе, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что, с целью увеличения выходажизнеспособности клеток, фракциоиирование проводят в изотонической сахарозной среде при следующем содер- . -жании компонентов; 250 мМ сахарозы,5 мИ хлористого калия, О,А мИ фосфорнокислого калия одноэамещенного,1,6 мИ фосфорнокцслого натрия. двузамещенного, 0,8 мИ хлористого маг"ния, 1,2 мИ хлористого кальция, 1 Хяльбумица,