Способ получения меченого j -тромбина

СОН)З СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИН БО,1 К 43 БРЕТЕНИ САНИ ЕЛЬСТВ Н ДВТОРСНО ый меди(72 би В 1 осЬев. 3,фМЕЧЕНОГО ци 1носится к имии и г способа 4. 21.5),Изобретение о в частности к би и касается новог ,о( -тромбина (КФ ИУдЦель и медицинематологии олучения меченого ние спебина -е с и че 5 д кто тив ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОЧНРЫТИ ПРИ ГКНТ СССР(71) Казанский государственнский институт им. С.В. Курашова.(57) Изобретение относится к медине, а именно к биохимии и гематологии, касается нового способа получ зобретения - повышей активности атром Способ о уществляется следующимобразом.Выделяли протромбин из кров ловека. Затем иодировали егохлораминовым методом и активировали в среде, содержащей тканевый тромбопластин, ионы кальция, фа ры свертывания крови Уа и Ха. Ак ационную смесь помещали на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой для отделения нетромбиновых продуктов активации. 1-ТромбйнЛ очищали далее методом хроматогра"фии. П р и м е р 1. Из 450 мл плазмыкрови человека получили 23 мг прония 1-тромбина (КФ 3.4.21,5) меченого 9, Цель изобретения - повышение специфической активности а-тромна -Я. Для этого выделяют протромбчн из крови человека. Затем кодировали его Я хлораминовым методом и активировали в среде, содержащей тканевый тромбопластин, ионы кальция, факторы свертывания крови Ла и Ха. Активационную смесь поме.щали на колонку с ДЭАЭ-целлапозой для отделения нетромбиновых продуктов активации, Далее а(-тромбин - 1,1 очищают методом хроматографии. 2тромбина с удельной биологической активностью 1345,6 ед/мг, Полученный протромбин метили 3. Для этого в полиэтиленовую пробирку внесли 1,25 мп раствора протромбина с концентрацией 17,8 мг/мл в 0,1 М фосфат ном буфере рН 7,4. Добавили к этому раствору 0,05 мп раствора Иа цЛ с радиоактивностью 1 мКи и 0,2 мп раст вора хлорамина Т (2 мг/мп). Инкубировали 30 с. Затем внесли 0,3 мл 0,1 М раствора метабисупъфита натрия и 0,3 мп 0,1 М раствора иодистого калия. Для отделения протромбина.1 от свободного иэотропа проводили 125гель-фильтрацию реакционной смеси на колонке (1,6 х 15 см) с сефадексом С, уравновешенным 0,05 М трис НС 1 буфером рН 7,4.Получили протромбин в1 с удельной радиоактивностью 2,05 х 10 расемин/мг (669,6 Ки/Моль) и свертываюшсй активностью 549,4 ед/мг. К 4,4 млСоставитель Г Вудякова Редактор Н, Козлова ТехредА.Кравчук, Корректор Н, Король Заказ 4362 .Тираж 528Подписное,ВНИИПИ Госуд арственного комитета по изобретениям н открытиям при ГКНТСССР 1,3035, Москвау Ж 35 р Раушская набор де 4/5Ыонзвадственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 1 д 1 раствора протромбина - "Л в 0,05 М трис-НС 1 буфере рН 7,4, содержащего 2,5 мМ СаС 1, добавили 1 мп суспензии тромбопластина (35 мп/мл) и по 0,1 мл свежей плазмы и сыворотки. Активацию проводили в течение 2,5 ч при 37 С, контролируя прирост биолоогической активности тромбина в смеси. После активации смесь центрифугировали 20 мин при 7000 я и 4 С, Тромбин - Я очищали далее хроматографией на колонке (16 х 10 см) с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенной 0,05 М фосфатным буфером рН 6,5. Фракции элюата, содержащне 1-тромбин - "5 д, нанесли на колонку (0,8 х 10 см) с ЯР-сефадексом, уравновешенным 0,05 М фосфатным буфером рН 6,5. -Тромбин злюировали 0,15 И фосфатным буфером рН 6,5, Получили 3 мг -тромбина - д с удельной радиоактивностью 4,18 х 10 расп/мин/мг (603,9 Ки/Моль) и со свертывающей активностью 2552,8 ед/мг, Ы Тромбин -Л давал одну белковую полоИ 5су при электрофорезе в полиакриламндном геле,П р и м е р 2, Из 550 мл плазмы человека получили 26 мг протромбина с удельной биологической активностью 1443 ед/мо. Протромбин метили 3. как и в первом примере, используя 1,13 мп его раствора с концентрацией 22,9 мг/мл и 0,048 мп раствора На Ч с радиоактивностью 1, 14 мКи.(1509, 03 Ки/Моль) и с биологической активностью 1022, 0,5 ед/мг.Активацию протромбина - ч 7 и очищение (-тромбина - дЗ проводилитакже как и в первом примере. ПолуО чили 3,5 мг ( тромбина - Яс удельной радиоактивностью 3,3 хх 10 7 расп/мин/мг (548,7 Ки/Иоль)и со свертывающей активностью2687,5 ед/м.Свертывающая активность о тромбина - дЛ 2356,8+4 б 1,1, ед/мг.Свертывающая активность о( тромбина - 3, полученного известным способом, 362,5+254,1 ед/мг.20Формула изобретения Способ получения меченого 3Ы-тромбина путем инкубации а(-тром ,бина с раствором На ,1 в растворехлорамина Т с последующей очисткой хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе и ЦР-сефадексе, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью увеличения специфической активности, радиоактивную метку инкубируютс неактив ной формой -тромбина - протромби- ном и актнвируют его в среде, содержащей тканевый тромбонластин, ионй кальция, плазму и сыворотку крови.