Способ определения малонового диальдегида в биологическом материале

Цель изобретен ности способа - до предотвращения тельных окрашеннь ции стиобарбитур ледуемую пробу фи ловым спиртом, эа барбитуровой кис пии этилового спирлипидов ние точ ления повыш ется вани сч образ о-. х соеовой ксируют тем обюл. У Ломон А.А. .8) 10 А ова опол динен кисло 70-90,ыре и вреа ой, Ис чаков А. 7-ным эти ывают тио лотойта 70 ние липидов вбранах. М.: Нау аба центра рик07.,ески агревают ект офотометриние малоноической плотсущественно точность определяют содер иальдегида по о при 560 нм. Спос ет селективность ЕЛЕНИЯ ИАЛОНОВОГО ЛОГИЧЕСКОИ ИАТЕ(54) СПОСОБ ОПРЕ ДИАЛЬДЕПЩА В БИ РИАЛЕ(57) Изобретение и может быть исп довании процесса с повь относится к биохимии льзовано при исслеперекисного окисзом.иологическиэтанолом в иксирунцевтрацификсироматериалонечнойК 1 мл тся 0-9". по объе ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМПРИ П(НТ СССР 4235138/28( ) 24.04.87(56) ВладимировПерекисное окислбиологических ме1972, с. 242,Изобретение относится к биохимии и медицине и может быть использовано . для количественного определения вторичного продукта перекисного окисления полиненасыщенных жирнокислотных остатков лиидов биологических образцов: тканевых препаратов, изолированных кЛеточных мембран, - как в интактном состоянии,таки при изучении окисляемости липидов в процессе индукции модельного перекисного окисления (ПОЛ).Цель изобретения - повышение точности способа за счет предотвращения образования дополнительных окрашенных соединений,Способ осуществляется следующим ЯО 1469460 определения малонового диальдегида и исключает применение агрессивных кислот - соляной и трихлоруксусной. ванного образца (образцы ткани предварительно должны быть прогомогенизированы в этаноле и отцентрифугирова ны) прибавляют 2 мл насыщенного раствора тиобарбитуровой кислоты (ТБК) (около 0,53) и нагревают 30 мин при 85 С. При этом конечная концентрация этанола составляет 25-327,. Полученные образцы охлаждают, центрифугируют или фильтруют для удаления денатурированного белка и определяют оптическую плотность при 532 ни относительно слепого образца или дистиллированной воды. Концентрацию малонового диальдегида (1 ЩА) рассчитывают по коэффициенту малярной экстинкции окрашенного триметинового комплекса, равному 156000 1сиП р и м е р 1. В суспензию мембран .саркоплазматического ретикулуиа1469460 Формула изобретенияСпособ определения малоновогодиальдегида в биологическом материале путем фиксации биопробы, обработки ее тиобарбитуровой кислотой принагревании, центрифугирования и последующего колориметрирования супернатанта, о т л и ч а ю щ и й с я тем,что, с целью повышения точностиспособа за счет предотвращения образования дополнительных окрашенныхсоединений, фиксацию пробы проводят70-90%"ньвк этиловым спиртом, а обработку тиобарбитуровой кислотойосуществляют в присутствии 25-32%ного этилового спирта,Составитель Н, Гуляева Техред И.Дидык Корректор Л, Патай Редактор К, Крупкина Заказ 1355/52 Тираж 788 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям прн ГКНТ СССР113035, Иосква, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Проиэводстненно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина,101 скелетных мьпдц кролика или лягушки (1 мг/мл по белку) вносят Ре 50 и аскорбат в конечных концентрациях 10 и 200 мкИ соответственно. Через 1, 3, 6, 10, 20 и 30 мин по 0,1 мл5 образца вносят в пробирки с 907.-ным этанолом или 30 .-ной трихлоруксусной кислоты (ТХУ) 1 мл. Затем добавляют по 2 мл 0,5 -ного водного раствора 1 О ТБК и нагревают 30 мин при 85 СОхлажденные пробы центрифугируют 5 мин при 3-5 тыс.8 и колориметрируют относительно пробы, взятой в нулевой момент времени, Осуществление определения ИДА н тем и другим способом дает практически одинаковые величины прироста этого продукта ПОЛ, однако проведение цветной реакции в присутствии ТХУ приводит к образова О нию интенсивно окрашенного ТБК - производного сахарозы (Л макс =445 нм), присутствующей в стандартной среде хранения мембранных препаратов. В то же время укаэанный пик отсутству ет, если в качестве фиксирующего агента использовали этанол (определение проводили в присутствии 327- ного этанола).П р и м е р 2. Аскорбат-зависи мое ПОЛ мембран ретикулума проводили, как в примере 1, за исключением того, что концентрация этанола при фиксации составляла 70%, в среде - 257., а вместо раствора ТХУ использовали дистиллированную воду. Корректное определение ИДА в водной среде возможно лишь в отсутствии ионов железа несмотря на то, что в обоих случаях не наблюдается взаи- щ модействия ТБК с сахарозой, вносимой в инкубационную среду вместе с фрагментами мембран. П р и и е р 3. Аскорбат - зависимое ПОЛ осуществляли, как в примере 1. На 30 мин после индукции ПОЛ аликвоты суспензии мембран добавляли к водно-этанольной смеси с разным количеством спирта. После этого осуществляли анализ ИЛА. Оптимальная конечная концентрация этанола, необходимая для осуществления исследуемой цветной реакции, составляет 25" 30 по объему, при фиксации 70-90 .Таким образом, предложенный способ определения малонового диальдегида в биологическом материале обеспечивает по сравнению с известныя существенное повышение селективности и точности определения ИДА при полном сохранении чувствительности метода-прототипа. В качестве фикси" рующего агента и компонента реакционной смеси используется нетоксичный и доступный реактив - этанол, полностью исключается применение агрессивных кислот - соляной н трихлоруксусной.