Способ получения вакцины против вирусного энтерита норок

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ВИРУСНОГО ЭНТЕРИТА НОРОК, включающий приготовление культуры клеток, выращивание штамма вируса в тканевой культуре, замораживание и оттаивание вируссодержащей суспензии, инактивацию вируса формальдегидом и добавление адъюванта, отличающийся тем, что, с целью повышения иммуногенности вакцины, в качестве штамма вируса используют штамм Р-1631 с титром вируса 10⁶ ЦПД₅₀ в 1 мл, замораживание вируссодержащего материала проводят при температуре от -20 до -40^oС, а инактивацию штамма вируса проводят раствором формальдегида при температуре 37^oС в течение суток, а затем при температуре 18^oС в течение 4 - 5 суток.

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и может быть использовано на предприятиях биологической промышленности для производства средств специфической профилактики вирусного энтерита норок.
Известна отечественная формолтканевая вакцина, которая не нашла широкого применения из-за содержания в ней большого количества белковых балластных веществ, образования у животных в местах инъекции отеков и абсцессов, сложности технологии приготовления и высокой стоимости изготовления [1].
Наиболее близким к предлагаемой является вакцина, описанная в патенте [2]. Эта вакцина изготавливается из инактивированного формальдегидом вируса энтерита норок, выращенного в культуре клеток почки котенка, и в качестве ростовой и поддерживающей среды применяется минимальная среда Игла, сыворотка крови ягненка или эмбриона крупного рогатого скота. Титр вируса при этом составляет 10^2,75 ЦПД₅₀ в 1 мл.
Однако известный способ требует для своего осуществления большого количества сыворотки, что чрезвычайно трудоемко и значительно удорожает стоимость вакцины. Кроме того, питательные среды не дают быстрого роста монослоя клеток, а титр вируса недостаточно высок и не позволяет полностью предохранять норки от заболевания вирусным энтеритом.
Целью изобретения является повышение иммуногенности вакцины.
Для достижения поставленной цели в способе получения вакцины против вирусного энтерита норок, включающем приготовление культуры клеток, выращивание штамма вируса в тканевой культуре, замораживание и оттаивание вируссодержащей суспензии, инактивацию вируса формальдегидом и добавление адъюванта, в качестве штамма вируса используют штамм Р-1631 с титром вируса 10⁶ ЦПД₅₀ в 1 мл, замораживание вируссодержащего материала проводят при температуре от -20 до -40^оС, а инактивацию штамма вируса ведут раствором формальдегида при температуре 37^оС в течение суток, а затем при температуре 18^оС в течение 4-5 суток.
П р и м е р. Для получения предлагаемой вакцины берут первично-трипсинизированную и выращенную культуру клеток почки котенка 2-6-месячного возраста. Используют ростовую среду, состоящую из 30% 0,5%-ного раствора гидролизата лактальбумина на растворе Хенкса, 30% среды 199, 30% среды Игла и 10% сыворотки крови крупного рогатого скота с добавлением антибиотиков: пенициллина (100 ед) стрептомицина (100 ед) и нистатина (50 мг на 1 мл). Ростовую среду с клетками разливают в стерильные колбы емкостью 1,5 л по 200 мл в каждую. Монослой культуры клеток почки котенка образуется на 4 - 5-й день после внесения суспензии клеток в матрасы.
Для заражения культуры клеток используют высоковирулентный штамм Р-1631 вируса энтерита норок. После образования монослоя сливают ростовую среду, вносят предварительно оттитрованный (до 10⁴ ЦПД₅₀ в 1 мл) в культуре клеток почки котенка вирус в количестве 20 мл, оставляют на монослое клеток в течение 1-2 ч при температуре 18-20^оС для контакта. Далее заливают поддерживающей средой, состоящей из 75% 0,5%-ного раствора гидролизата лактальбумина на растворе Эрла и 25% среды Игла с добавлением аналогичных для ростовой среды антибиотиков. Культивируют вирус при температуре 37^оС.
Характеристика штамма вируса инфекционного энтерита норок Р-1631.
Штамм Virus enteritis enterlarum Р-1631 предназначен для приготовления вакцины против вирусного энтерита норок.
Хранится в Государственной коллекции института вирусологии им. Д.И. Ивановского АМН СССР.
Морфологические признаки. Вирус отнесен к группе парвовирусов и содержит однонитчатую ДНК. Размножается в пассажах на тканевой культуре почки кошек, норок и африканских хорьков с цитопатогенным эффектом на 7-8 сутки. Титр вируса 10^-6 - 10^-7 ЦПД₅₀ в 1 мл. Патогенен для норок. Не обладает гемагглютинирующей способностью. Содержит преципитирующий и комплементфиксирующий антиген.
Физиологические признаки. Устойчив к действию желчи, эфира, хлороформа, трипсина, карболовой кислоты, лизола и антибиотиков. Оптимальный рН 6,0 - 8,0. Сохраняется при -20^оС со дня выделения по настоящее время (3 года) в высушенном состоянии 2,5 года (срок наблюдения), в глицерине 1 год. При нагревании до 52^оС погибает в течение 2 ч, до 100^оС - моментально. Формалин убивае вирус в течение 3 ч, щелочи - в течение суток.
Иммуногенные и вирулентные свойства. При заражении норок per os внутрибрюшинно и внутримышечно штамм "Родники-1631" вызывает 100%-ную гибель зверей на 6 - 8-й день после его введения. Животные погибают с характерными клиническими и патоморфологическими признаками.
На 7-8-й день после выращивания вируса, когда достигался его наиболее высокий титр 10⁶ ЦПД⁵⁰ в 1 мл, матрасы с вируссодержащим материалом и поддерживающей средой замораживали при температуре от -20 до -40^оС, что обеспечивало наиболее высокий выход вируса из клеток. Через 24 ч вируссодержащую суспензию оттаивали при температуре 10^оС и неоднократно встряхивали для тщательного удаления клеток с поверхности стекла и полного выхода вируса из клеток.
После оттаивания вируссодержащую суспензию их всех матрасов сливали в один сосуд и добавляли в нее формалин из расчета 0,04% формальдегида в жидкости. Вирус инактивировали в течение 24 ч при температуре 37^оС, а затем в течение 4-5 дней - при температуре 18^оС. Обязательным требованием при этом являлось ежедневное тщательное встряхивание вируссодержащей суспензии для полной инактивации вируса. После инактивации вируса суспензию проверяли на бактериальную и грибковую загрязненность путем посева на питательные среды (мясопептонный бульон, мясопептонный агар, мясопептонно-печеночный бульон под вазелиновым маслом и среда Сабуро), а затем на безвредность путем внутрибрюшинного введения чувствительным к вирусу норкам в дозе 5 мл и подкожной инъекции белым мышам в дозе 1 мл.
Перед расфасовкой вакцины в нее добавляли (в расчете на 1 мл) 0,10 - 0,12% гидроокиси алюминия и 5% глицерина в качестве адъювантов.
Срок хранения вакцины при температуре 2 - 4^оС равен 16 месяцам.
Вакцина вводится норке в дозе 1 мл внутримышечно в области бедра.
Изготовленная предлагаемым способом вакцина высокоэффективна и создает напряженный иммунитет у привитых животных в течение 15 месяцев.
Широкие производственные испытания предлагаемой вакцины в 1978 г показали, что при ее использовании случаев заболевания норок вирусным энтеритом не наблюдалось.
Предлагаемый способ позволяет получать вирус в массовом количестве, что значительно упрощает технологию приготовления вакцины.