Способ получения аденозин-5-трифосфата

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АДЕНОЗИН-5'-ТРИФОСФАТА, предусматривающий накопление биомассы дрожжей на питательной среде при оптимальных условиях роста с последующим выделением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, полученную биомассу предварительно суспендируют в дистиллированной воде и водную суспензию дрожжей обрабатывают озоновоздушной смесью с дозой озона 5 10⁸ - 5 10⁹ молекул О₃ на клетку до снижения активности дыхания на 20 - 50%.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения аденозин-5^I-трифосфата (АТФ) с помощью микроорганизмов.
Цель изобретения - упрощение способа.
Способ заключается в обработке водной суспензии дрожжевой культуры, выращенной на углеводоминеральной среде, озоновоздушной смесью с концентрацией озона 5 10⁸-5 10⁹ молекул на клетку при комнатной температуре до снижения дыхания дрожжей на 20-50%, последующем удалении дрожжевых клеток и выделении АТФ из супернатанта любым известным способом.
Количество продуцированной АТФ в каждом примере определяют использованием реакции между АТФ и люциферинлюциферазой, которая выражается следующим образом:
Люциферинлюцифераза + АТФ адениллюциферин + пирофосфат (1).
Адениллюциферин ^O2 аденилоксилюциферин.
Интенсивность свечения флюоресцирующего продукта второй реакции в интервале длин волн 560-580 нм измеряют в течение данного периода времени с использованием флюориметра и полученный результат соотносят с предварительно полученной калибровочной кривой стандартных растворов АТФ, в результате чего определяют количество АТФ, вышедшей из клетки в инкубационную среду.
Обработку озоном осуществляют однократно или путем последовательных обработок. Суммарная доза озона должна составлять 5 10⁸ - 5 10⁹ молекул О₃/клетку и обеспечивать снижение активности дыхания дрожжей на 20-50%.
Экспериментально установлено, что при обработке озоном в более низких дозах накопления АТФ не происходит (допороговая доза), а при обработке дозой более 5 10⁹ молекул О₃/клетку дрожжевые клетки разрушаются. При выдерживании водной суспензии дрожжевых клеток более 2 ч выход АТФ снижается.
П р и м е р 1. Кормовые дрожжи Candida utilis выращивают в колбах объемом 1,0 л с глюкозоминеральной средой следующего состава, г/л водопроводной воды: глюкоза 10,0; КН₂РО₄ 1,0; NaCl 0,5; Ca(NO₃)₂ 0,4; К₂НРО₄ 0,1; MgSO₄ 0,7; (NH₄)₂SO₄ 3,0, при исходном рН 6,2, температуре 28^оС в течение 18-20 ч с непрерывной аэрацией путем барботирования воздухом с интенсивностью потока 0,4-0,7 л/мин. Клетки собирают центрифугированием, дважды отмывают дистиллированной водой, а затем готовят 5%-ную суспензию (по сырому весу) в дистиллированной воде. Клеточную суспензию обрабатывают озоном путем пропускания озоновоздушной смеси при интенсивности потока 1,5 мкмоль О₃/мин и дозе 5 10⁸ молекул О₃/клетку. Контроль за эффективностью озонирования осуществляют по измерению активности дыхания дрожжевых клеток с помощью полярографического метода. При снижении активности дыхания на 10-20% обработку озоном прекращают. Озонированнную суспензию клеток инкубируют в течение 30 мин и отделяют клетки центрифугированием. Полученный супернатант доводят соляной кислотой до рН 3,5, обрабатывают активированным углем для адсорбции АТФ, которую затем элюируют 50%-ным раствором этилового спирта, содержащим 1,4% аммиака. Этот элюат концентрируют при пониженном давлении и при низкой температуре для удаления избытка аммиака доведением рН до 8,0. Затем концентрированный раствор пропускают через колонку сильноосновного катионита, в результате чего АТФ адсорбируется на колонке. Адсорбат промывают бидистиллированной водой и элюируют смесью соляной кислоты и хлористого натрия, рН 1,7. Фракцию АТФ отделяют, элюат нейтрализуют едким натром, пропускают через колонку, набитую активированным углем, элюируют 15%-ной аммиачной водой и полученный элюат концентрируют при нагревании для отгонки аммиака. Путем добавления метанола к концентрированному раствору получают кристаллическую натриевую соль АТФ. Выход 2-3 г на 1 кг источника углерода (глюкозы) в среде выращивания дрожжей.
П р и м е р 2. Условия роста дрожжевых клеток С.utilis и подготовка их к озонированию такие же, как и в примере 1. Однако дозу озонирования увеличивают до 5 10⁹ молекул О₃/клетку с темъчтобы обеспечить подавление активности дыхания на 50% по сравнению с исходным уровнем. Выход АТФ 5-10 г на 1 кг источника углерода в среде выращивания дрожжей.
П р и м е р 3. Хлебопекарные дрожжи Saccharomyces cerevisiae выращивают в колбах объемом 750 мл со 100 мл питательной среды на качалке (180-200 об/мин) при 30^оС в течение 20-24 ч. Составсреды, г/л: (NH₄)₂SO₄ 3,3; MgSO₄ 0,7, NaCl 0,5; KH₂PO₄ 1,0, К₂НРО₄ 0,13, рН среды 7,0. В качестве источника углерода используют мелассу (2% по сахару). Клетки собирают центрифугированием, дважды отмывают дистиллированной водой, а затем готовят 5%-ную суспензию (по сырому весу) в дистиллированной воде. Клеточную суспензию обрабатывают озоном, обеспечивая дозу 3-5 10⁹ молекул О₃/клетку, что приводит к подавлению активности дыхания клеток на 30-50% по сравнению с исходным уровнем. Выход 3-6 г на 1 кг мелассы.
Как видно из примеров, предлагаемый способ получения аденозин-5^I-трифосфата озонмодифицированными клетками дрожжей дает хороший результат с наиболее широко используемыми в настоящее время промышленными культурами, а именно, кормовыми, пивными и хлебопекарными дрожжами.
Таким образом, способ получения аденозин-5^I-трифосфата обладает следующими преимуществами. Он прост в осуществлении: сложная среда инкубации с предшественниками АТФ аденином или аденозином заменяется дистиллированной водой, а инициатором синтеза АТФ является озон, накопление целевого продукта происходит в воде, что упрощает его выделение и очистку.
Для получения целевого продукта таким способом не требуется дорогостоящих предшественников (аденина, аденозина).
Отработанная биомасса клеток может быть без дополнительной очистки использована для получения кормового белка, поскольку не содержит токсических добавок ( толуола) в отличие от известного, следовательно, способ является экологически чистым.
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения аденозин-5'-трифосфата (АТФ) с помощью микроорганизмов. Цель изобретения - упрощение способа получения АТФ. Способ заключается в обработке водной суспензии дрожжевой культуры, выращенной на углеводоминеральной среде, озоновоздушной смесью с концентрацией озона 5 10⁸-5 10⁹ молекул O₃ на клетку так, чтобы активность дыхания дрожжей снизилась на 10 - 50%, после чего дрожжевые клетки удаляют, а АТФ выделяют из супернатанта известным способом. При этом не рекомендуется выдерживать водную суспензию дрожжей более 2 ч, так как снижается выход АТФ. Способ прост в осуществлении, так как сложная среда инкубации с дорогостоящими предшественниками АТФ-аденином или аденозином - заменяется дистиллированной водой, а инициатором синтеза АТФ является озон, к тому же накопление целевого продукта в воде упрощает его выделение и очистку. Способ является экологически чистым.