Способ прогнозирования течения реконвалесцентного периода острого вирусного гепатита в у детей

(я)5 6 01 М 33/53 ИЕ ИЗОБРЕТЕНИ Изобрете сается облас вопросов диа ковалесценц та Ь (ОВГВ). Целью яв новоти диагнос Способ осрмен ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕВЕДОМСТВО СССР(71) Рижский медицинский институт(56) Приказ МЗ СССР М 752 от 1981 г, полечению и диспансеризации детей ВГВ.(54) СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ТЕЧЕН)Я РЕКОНВАЛЕСЦЕНТНОГО ПЕРИОДАОСТРОГО ВИРУСНОГО ГЕПАТИТА В УДЕТЕЙ(57) Изобретение относится к медицине, вчастности к гепатологии, и может быть использовано для прогнозирования теченияреконвалесцентного периода острого гепатита у детей, Цель - повышение точностиспОсоба, Для этого в первые 3 - 6 месяцапериода реконвалесценции определяют вение относится к медицине, кати гепатологии, в частности ностики течения периода реии острого вирусного гепатиляется повышение специфичтики.уществляется следующим об раЭом,Методика постановки имм ного анализа В лунки платы в ного в фосфатно-сол 7,4 липопротеида пе инкубируют 10 - 16 ча Отклеивают пла антигена ФСБ рН 7,4носят 100 мл разведеневом буфере (ФСБ) рН цени человека (ЛПЧ) и сов при +4 - +100 С, ту от несвязавшегося ; Во всех последующих личину титров антител 9 М класса к липопротеиду печени человека, при этом посадку липопротеида на полистироловые планшеты проводят в фосфатно-солевом буфере рН 7,4, при получении первичного комплекса антиген-антитело сыворотку больного раститровывают с шагом 1/3, инкубируют 10 - 14 ч при температуре 4 - 10 С, отмывку проводят фосфатно-солевцм буфером рН 7,4, в качестве конъюгата используют иммуноглобулины класса 9 М, меченные пероксидаэой, связывание конъюгата с антителами проводят в 1 растворе овечьего сывороточного альбумина, приготовленного на фосфатно-солевом буфере рН 7,4, при титрах антител 1,3600 - 1:10800 диагностируют благоприятное течение реконвалесценции, а при титрах 1:400-1:1200 диагностируют неблагоприятное течение реконвалесценции вирусного гепатита В,тадиях отмывку проводят тем же реагеом. В лунки платы помещают по 100 мл предварительно разведенной в ФСБ рН 7,4 от 1:400 до 1:10800 (с шагом 1/3) исследуемой сыворотки больного и отрицательного контроля (пул сывороток здоровых доноров). Инкубируют 10 - 16 ч при 4 - 10 С.Удаляют избыток образцов из лунок, Плату отмывают.В лунки вносят 100 мкл конъюгата (иммуноглобулинов; меченных пероксидазой), разведенного в растворе 170 бычьего сывороточного альбумина (БСА), приготовленного на ФСБ рН 7,4. Инкубируют 1 при 37 С.Удаляют избыток конъюгата из лунок, плату отмывают.Помещают в лунки по 100 мкл субстратной смеси (перекиси водорода и 5-аминосалициловой кислоты). Инкубируют плату 1 чпри комнатной температуре.Результаты определяют на фотометрепри длине волны 450 мм, Если титр антителснижается ниже 1:3600 (1:1200, 1;400, меньше 1;400) это показатель неблагоприятноготечения реконвалесцентного периода. Еслититр повышается выше 1:3600 (1:10800,1;32400) - это указывает на благоприятноетечение периода реконвалесценции ОВГВ,Положительный эффект, достигаемый. при использовании изобретения, заключается в повышении достоверности диагностики благоприятного и неблагоприятноготечения периода реконвалесценции приОВГВ у детей,Было обследовано 33 ребенка больныхВГВ, у которых в результате диспансерногонаблюдения по совокупности общепринятых клинико-биохимическим критериям, выявили благоприятный (21 ребенок) инеблагоприятный (12 детей) течение периода реконвалесценции ВГВ,Как следует из данных, ложноположительное повышение показателей активностиАлАТ при благоприятной реконвалесценцииотмечается в 9 из 21 случая, т.е. в 43 ч= 11 ф ,а ложноотрицательные показатели активности АлАТ при неблагоприятной реконвалесценции отмечается в 5 из 12 случаев,т.е. ЗЗ + 14 . Следовательно правильныйответ с помощью способа-прототипа былполучен в 20 из 33 случаев, т,е. 60 .ф. 9 .С помощью нового способа, правильныйответ был достигнут в диагностике благоприятного варианта реконвалесцентногопериода в 20 случаев, т.е, в 95;4, а в диагностике неблагоприятного варианта в 11 случаев, т.е, 91 . Таким образом, с помощью нового способа правильный диагноз основных вариантов реконвалесцентного периода был установлен в 31 случаев, т,е, в 93+ 3.В процессе разработки нового способа экспериментально были исследованы следующие этапы его осуществления:Оптимальные условия связывания антигена путем "пассивной" адсорбции были достигнуты при использовании фосфатносолевого буфера (ФСБ) рН 7,4, Инкубация при+4 - +10 С в течение 10-14 часов сведений к минимуму колебания в содержании связанного антигена, что дает хорошую воспроизводимость результатов;при использовании физиологического раствора с добавкой 0,05; твинсвязы 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 вания антигена с подложкой не происходило,Применение 0,01 М карбонатного буфера рН 9,5 требовало большего, чем в случаес ФСБ количества антигена (в 2,5 раза), чтоприводило к увеличению числа ложноположительных результатов, появлению фона.Таким образом, оптимальных результатов при связывании антигена с поверхностью платы можно достигнуть лишь прииспользовании ФСБ рН 7,4.После сорбции для отмывки от избыткаантигена наиболее приемлемым оказалсяФСБ рН 7,4. Использование в качестве добавки к нему твинили замена его физиологическим раствором приводили кчастичному снятию антигена с подложки,что приводило к увеличению фона и снижению воспроизводимости анализов.Предварительное разведение исследуемых образцов до 1:400 с последующим шагом титрования позволяет надежнопроводить инситирование антител в подходящем диагнозе концентраций с достаточной точностью определения.Шаг титрования 1/2 не позволяет с достаточной степенью точности проводитьдифференцию образцов,Шаг титрования 1/5 приводит к сужению возможности точного определенияпрогностически значимых титров,Исследуемые образцы инкубировали10 - 14 часов при +4 - +10 С что позволилоснизить уровень неспецифического связывания увеличить чувствительность метода,П р и м е р 1. Ребенок П., 4-х лет,М дисп,карты 1721, с диагнозом вирусногогепатита В, В периоде реконвалесценциижалобы отсутствуют, размеры печени в пределах нормы, При определении титра антител к протеидному антигену печени класса9 М, он был равен 1:3600, что послужилообоснованием для диагноза благоприятного варианта течения реконвалесценциибольной. Однако активность аланинаминотрансферазы (АлАТ) выявилось 70усл,ед. (норма до 50 усл.ед,), что бы далооснование предполагать неблагоприятный вариант течения реконвалесценции.Последующим диспансерным наблюдением в течение полугода установлено отсутствие субъективных и объективных проявленийналичия патологического процесса печени, вчастности нормализовалась АлАТ, тимоловаяи сулемовая пробы, Ребенок признан здоровым. Тем самым подтверждена правильностьдиагноза благоприятного варианта рекон- .валесценции после перенесенного вирусного гепатита В.1802324 С поьдиаглесц12 де ощью способа-прототипа правильныйоз благоприятного варианта реконвантного периода ВГВ был установлен уей, из 21 ребенка, т.е, только 57 й 11% 40 Составитель Г.Крюкова Редактор В,Трубченко Техред М.Моргентал, Корректор А.ОбручарЗаказ 847 Тираж ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101 П р и м е р 2, Ребенок В., 3 года,1 Ф диспансерной карты 2114, с диагнозомвируного гепатита В, период реконвалесценцйи,Ребенок, кроме ускоренной усталости, 5жалобы не предъявлял, печень - нижнийкрай Ье выступал на 0,5 см, по правой сосковой л нии.:ри определении титра антител к протеидому антигену класса М, он оказался 10повышенным, равным 1:10000, На этом основании был выставлен диагноз - благоприятный вариант течения реконвалесцентногопери да болезни,днако активность АлАТ - 190 усл,ед. 15(норМа до 50 усл,ед.), Это дало повод предположить диагноз неблагоприятного варианта влечения периода реконвалесценции.Последующим диспансерным наблюденим в течение 7 месяцев была отмечена нормализация активности АлАТ принормальном содержании проведенныхколлдидно-осадочных проб и билирубина,на фФне отсутствия субъективных и объективных данных патологического процесса. 25Таким образом, была подтверждена достоверность диагноза благоприятного вариантарековалесцентного периода у ребенка после перенесенного ВГВ, поставленного спомоцью нового способа. 30Гоказано, что диагноз благоприятногдрековалесцентного периода ВГВ был подтвержден в результате длительности 6 - 8месяцев диспансеризации детей с учетомотсутствия клиника-биохимических признаков активности патологического процесса,случаев, у которых активность АлАт находилась в пределах нормы, У остальных 9 реконвалесцентов активность АиАТ находилась выше нормы (65 - 195 усл,ед.). При учете титра антител к протеидному антигену печени класса 1 дМ, правильный ответ получен в 15 иэ 21 случая, 14,4%, т,е. Р0,5. Только при использовании нового способа путем определения антител к протеидному белку печени класса 1 дМ в 20 случаев был правильно диагностирован благоприятный вариант реконвалесценции ВГВ.Формула изобретения Сгтособ прогнозирования течения реконвалесцентного периода острого вирусного гепатита В у детей путем исследования сывороток крови больных, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения точности способа, в первые 3 - 6 месяцев периода реконвалесценции определяют величину титров антител 1 дМ класса к липопротеиду печени человека с помощью иммуноферментного анализа, при этом посадку липопротеида на полистироловые планшеты проводят в фосфатно-солевом буфере с рН 7,4, сыворотку больного рэститровыванную с шагом 1/3, инкубируют 10 - 14 ч при температуре 4 - 10 С, отмывают фосфатно-солевым буфером с рН,4, в качестве коньюгата испол ьзуют иммуноглобулин ы класса д М, меченные пероксидазой и связывание коньюгэта с антителами проводят в 1%-ном растворе бычьего сывороточного альбумина, приготовленного на фосфатно-солевом буфере с рН 7,4, и при титрах антител 1;3600 - 1:10800 прогнозируют благоприятное течение реконвалесценции, а при титрах 1:400 - 1:1200 прогнозируют неблагоприятное течение реконвэлесценции вирусного гепатита В.