Способ сохранения генофонда сортов и видов картофеля

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИН З(51) А 01 Н /04; С 12 М 5/00А ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ЕЛЬСТ ВТОРСКОМУ СВ 2. Способ то затравку при. 1, отличающийся тем,зводят в течение 1,0+ 0,3 с. ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(71) Институт физиологии растений им, К. А. Тимирязева(56) 1. Ва)а ЧР 5, Кедапега(оп о 1 рапгв 1 гогп рогато гпегМегпв 1 гееге - ргевегчег аког 24 гпоп 1 Ьв, Ецрйу(1 са, 1981, ч. 30,1, р. 141.2, ТоМ 11 1 Я. Яоапцгп е 1 цЬеговцгп; а гпоге 1 1 ог Мцгу 1 пд (Ье сгуоЬоору о 1 зоо 1 вг 1 рв п гпе 1 цЬег-Ьеагпд Ьоапцгп зресез. Рап( Яс 1 епсе 1.ег 1 егз, 1981. ч. 20,4, р. 315.(54) (57) 1. СПОСОБ СОХРАНЕНИЯ ГЕНОФОНДА СОРТОВ И ВИДОВ КАРТОЯО 1055437 А ФЕЛЯ, включающий предварительное культивирование меристематических верхушек на питательной среде, охлаждение объекта в ампулах в присутствии криопротектора, затравку кристаллизации, последуюшее замораживание и хранение в жидком азоте, отличающийся тем, что, с целью сохранения высокого уровня жизнеспособности меристем и упрощения способа криоконсервации, меристематические верхушки для охлаждения помешают в верхнюю часть ампулы, разделенной проницаемой поперечной перегородкой, а затравку кристаллизации производят путем помещения нижней части ампул в жидкий азот до начала образования кристаллов.Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к способам низкотемпературного хранения тканей и клеток растений, и может быть использовано в селекции и семеноводстве для длительного сохранения генофонда картофеля.Известен способ сохранения генофонда картофеля, основанный на глубоком замораживании меристематических верхушек, Меристематические верхушки, после предварительного культивирования на жидкойпитательной среде в течение 3-5 сут и последующей инкубации на среде с криопротекторами в течение 1 ч быстро погружают на кончиках стерильных игл или в пластмассовых ампулах прямо в жидкий азот. Этот способ позволяет сохранить жизнеспособность меристематических верхушек в пределах от 27/О до 76 /О для культурного и для дикого видов соответственно 11). 1 О 15 Недостатком этого способа является сильное варьирование по уровню жизнеспособности между замороженными образцами после оттаивания.Известен также способ криоконсервации меристематических верхушек картофеля после предварительной подготовки по аналогии с указанными способами, отличительной чертой которого является медленное охлаждение апексов в присутствии криопротектора со скоростью 0,3 С/мин до 40 С с последующим быстрым погружением в жидкий азот . В этом способе в ходе замораживания производят затравку (искусственную инициацию кристаллизации) раствора криопротектора путем внесения кусочка льда в ампулу с помощью микро- пипетки при температуре - 5 С. Такой способ позволяет сохранить жизнеспособность апексов на уровне 71/о после криоконсервации 2.Однако способ имеет ряд недостатков. После предварительной подготовки ампулы с меристематическими верхушками помещают в спиртовой раствор с температурой5 С и через 10 мин производят затравку кристаллизации, Для этого в стерильных условиях в каждую ампулу по отдельности вносят кусочек льда с помощью микропипетки, и через 10 мин медленно (примерно 0,3 С/мин) снижают температуру спиртового раствора с помогцью системы сосудов Дьюара, охлаждаемой жидким азотом. При значительном количестве ампул такой способ усложняет и удлиняет весь процесс замораживания. Кроме того, не исключается возможность инфицирования меристематических верхушек в процессе затравки. Таким образом, известный способ криоконсервации является громоздким и трудоемким, так как требует стерильных условий при замораживании и проведении ряда дополнительных операций. 20 25 30 35 40 45 50 55 Целью изобретения является сохранение высокого уровня жизнеспособности меристематических верхушек картофеля в процессе медленного замораживания и последующего хранения в жидком азоте, а также упрощейие способа криоконсервации.Поставленная цель:достигается тем, что перед замораживанием меристемазические верхушки помещают в раствор криопротектора в верхнюю часть ампулы, разделенной поперечной перегородкой с отверстиями, которая предотвращает непосредственное повреждение меристематической ткани в момент затравки, процесс охлаждения ведут в программном замораживателе, а затравку раствора криопротектора, находящегося в нижней части ампулы под перегородкой, производят путем одновременного погружения дна всех ампул в жидкий азот до начала образования кристаллов.При этом затравку производят в течение 1,0+ 0,3 с. Температуру в камере аппарата поддерживают неизменной до момента образования кристаллов льда во всем объеме раствора криопротектора. Тем самым обеспечивается медленная дегидратация меристематической ткани, что в свою очередь препятствует кристаллизации воды внутри клеток.Пример. Для замораживания используют меристематические верхушки культурного тетраплоидного вида картофеля сорта Домодедовский, Предварительная подготовка апексов заключается в культивировании их на жидкой питательной среде с 5 О/о ДМСО (диметилсульфоксид) в течение 24 ч. Размер апексов 250-500 мкм. Условия культивирования: температура 26 С, освещенность 5000 лк, постоянный свет, влажность 70%. После предварительной подготовки меристематические верхушки переносят в 1,0 мл 5/о-ного раствора ДМСО в питательной среде в ампулы с поперечной перегородкой, плотно прилегающей к стенкам и разделяющей весь объем раствора ДМСО на две равные части, сообщающиеся между собой через два отверстия диаметром 0,2 мм в поперечной перегородке. Таким образом, замораживаемый объект отделен от зоны образования и первоначального быстрого роста кристаллов льда, происходящего в момент затравки. Меристематические верхушки охлаждают в программном замораживателе со скоростью 0,5 С мин. При температуре - 5 С производят затравку сразу всех ампул, находящихся в специальном штативе, путем погружения их дна в жидкий азот на 1,0 с. После этого температуру в камере замораживания поддерживают на уровне - 5 С в течение 20 мин, а затем продолжают охлаждение замораживаемого объекта с первоначальной скоростью до - 40 С, после чего сразу погружают в жидкий азот ( - 196 С). После хранения в жидком азоте ампулы быстро размо1055437 Способзатравки Средний уровеньжизнеспособностимеристематическихверхушек после до замораживания(контроль),замораживания (хранения,оттаива - ния), о Внесение кусочков льда в ампулы с помощьюмикропипетки встерильных условиях х71,0 96,0 Погружение днаампул с поперечной перегородкой в жидкийазот на 1,0 с 95,0 84,0 Данные взяты из работы Тоуилла 2. Составитель С. Куваева Редактор А. Шишкина Техред И. Верес Корректор О. Тигор Заказ 9179/5 Тираж 721 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж - 35, Раушская наб., д. 4/5 Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 43раживают в воде при 40 С, и меристематические верхушки высаживают на агаризованную среду. Условия рекультивировайия такие же, как и при предварительной подготовке материала к замораживанию. Жизнеспособность апексов после оттаивания определяют путем подсчета количества развивающихся меристематических верхушек после рекультивирования на питательной среде в течение 7-10 дней. Уровень жизнеспособности меристематических верхушек в зависимости от способа криоконсервирования показан в таблице. Предлагаемый способ позволяет увеличить средний уровень жизнеспособности меристематических верхушек на 13% по сравнению с известным способом, а также 5является менее трудоемким, так как значительно упрощает и сокращает процесс замораживания за счет исключения из него всех операций, необходимых для проведения затравки раствори криопротектора в стерильных условиях путем внесения ку сочка льда в него с помощью микропипетки.