Способ получения последовательности днк, содержащей фрагмент, кодирующий человеческий проаполипопротеин а-1

Номер патента: 1834904

Авторы: Алекс, Эрнст, Жан

Есть еще 14 страниц.

Смотреть все страницы или скачать ZIP архив.

Текст

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРеспУБЛик 12 й 15/1 1)5 Е Е ТЕНТ Е) и Эрнс СЛЕДОВА-, ЕЙ ФРАГ- ЕЧЕСКИЙ Аецитом апо в, проапо вива" сп фермен ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОВЕДОМСТВО СССРГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗО(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПТЕЛЬ НОСТИ ДН К, СОДЕ РЖАМЕНТ КОДИРУЮЩИЙ ЧЕЛОПРОАПОЛИПОПРОТЕИН АИзобретение касается способа получения новой последовательности дезоксирибонуклеиновых кислот (ДНК), содержащей фрагмент, кодирующий человеческий проаполипопротеин А.Человеческий аполипопротеин А(апо А) является основным белковым составляк 1 щим липопротеинов высокой плотности (1 НО) и хиломикронов лимфы. Печень и тонкая кишка являются основными центрами синтеза апо А - 1, Апо Асинтезируется в этих органах в форме белкового предшественника(препроапо А - 1). Совместное трансляционное расщепление препептидэ происходит внутри клетки, и проапо А -секретируется в плазме и в лимфе.Проапо А - 1 содержит шесть дополнительных аминокислот (Агц - Н 1 в - РЬе - Тгр 61 пи), которые присоединяются к концевой эминогруппе апо А - 1. Достигнув(57) Использование: генетическая инженерия, рекомбинантная технология получения, Сущность изобретения: способ получения последовательности заключается в том, что в вектор р ВЯ 322 клонируют фрагмент ДНК, полученный путем сшивки ВаИ - Рзт фрагмента, кодирующего аминокислоты+ 15 - +24 с фрагментом ДНК, кодирующим аминокислоты от -б до +14 полипептида и включающим кодом инициации трансляции, а также модифицированные кодоны для аминокислот: -б, -1, +1, +3, +4, +5, +6, +7, +10, +11 и+1 1, получают клоны и отбирают клоны, кодирующие человеческий проаполипопротеин А - 1. 7 ил,области расположения сосудорасщепляется в условиях "инфическим протеолитическим(апо А -пропептидаза), образуя зрелый А - 1,Этот зрелый апо Апредставляет собой уникальный негликозилированный полипептид известный пос:едовэтельности, состоящий из 243 аминокислот (Н, В, Вгеюег и др., В 1 осЬев Вормуз. Вез. Соввип 80, 1978 г., с. 623 - 630); он служит в качестве кофактора для плазматического фермента лицитинэ:холестеролацилтран рсферазы, которая ответственна за образование в плазме большинства сложных эфиров холестерина, Дефекты в структуре или биосинтезе аполипопротеина могут привести к нарушению в системе переноса плазматических липидов и к развитию заболевания коронарных артерий. Показано, что низкиеотобраны на их стойкость к ампициллину иподвергаются отборочному просеву с 18 -мерным синтезированным олигонуклеотидом(тот же, что использован в синтезе адаптора, как показано на фиг. 2).Отобранные трансформанты подвергаются контролю путем ограничительногоанализа для проверки правильной ориентации последовательности ДНК проапо А относительно последовательности сигнального пептида, носителем которого являетсявектор секреции (воспроизводимая точкаЕсо 81 на стыке двух последовательностей),Одна из трансформант несет рекомбинантную плазмиду, которая отвечает данномуусловию, Излишняя последовательность,происходящая от построения с адаптером,подчеркнутая в приведенной ниже нуктеотиднрй последовательности:в зтйсанйапссБдрдыещАОА САТ ТТС ТОО 3Ча А 1 а С 1 М Аа А 1 А О 10 РЬе Мет Аг 9 Н 1 зРЬе Тгрустраняется посредством направленногоак - 6 мутагенеза. С этой целью осуществляется синтез нижеследующего 24 - мерногоолигонуклеотида:сигнальный пептид- -.,4- -праапо А-5 ОТА ОСО ОАО ОСС АОА САТ ТТСТОО 3Ча 1 А а О 1 п А 1 а АВ 9 Н 1 з РЬе Тгрлишенного 12 излишних оснований, и ониспользуется для удаления излишней последовательности из 12 оснований, происходящей от адаптера.Для осуществления мутагенеза используется система Амершам. Эта система основана на способе Г, Ес 1 ме 1 п и др, (чос 1 есАсЫз Вез, 13, 1985 г 8765-8785). Данныйспособ обеспечивает высокий выход продукта и наиболее высокую эффективностьиз числа существующих способов: вплоть до95 оВ первую очередь, область ДНК, которая предварительно мутагенизирована,клонируется в вектор М 13, С. этой цельюфрагмент ДНК ХЬа 1 - ВЗЦ рекомбинантнойплазмиды р 1 И - 1 И - оарА - 2, несущий генпрозпо А, вставляется в вектор М 13 ер 9,отсеченный ХЬа 1 НпбИ. Этот векторМ 13 щр 19 промышленно доступен; он можетбыть получен согласно Амершам(Вцсйпдйагязйге Великобритания). Затеммутагенный 24 - мерный олигонуклеотидгибридиэируется с моноцепочечным матриксом и вытягивается фрагментом КленоваДНК полимеразы в присутствии ДНК лигазыТ 4 для получения мутантного гетеродуплекса, 50 5 10 15 20 25 30 35 40 Избирательное удаление немутантной нити возможно за счет ввода тионуклеотида в мутантную нить в ходе синтеза в условиях ин витро и за счет расщепления нить МС 1, не подвергнутой фасфоротианатированию. Такие расщепления дают точки для экзонуклеаэы 11, которая вываривает нить, не являфющуюся мутантом, В таком случае нить, являющаяся мутантом, используется как матрикс для перестройки круговой молекулы с двойной нитью, приводящий к образованию монодуплексной мутантной молекулы. Такой мутагенез подтверждается последовательностью соединения между сигнальными пептидом и началом гена проапо А. Данная рекомбинантная плазмида рйУ 1612 перестраивается путем сшивки фрагмента ХЬа - Нпб И 1 в вектора р 1 - 1 - оврАс фрагментом ХЬа 1 - Ва 1 1, который лишен 12 излишних оснований, и с фрагментом Ва 1 1 - Н 1 пб 1 гена проапо А,Эти три фрагмента линейно выравниваются посредством ДНК лигазы Т 4, и данная смесь используется для трансформации компетентных клеток Е. со 1 ТР 221, как описано выше, Эти трансформанты отбираются по их стойкости к ампициллину и просеиваются с 18 - мерным олигонуклеотидом, описанным выше. Одна иэ трансформент несет рекомбинантную плазмиду рй 1 У 1612. В данном кс 1 нечном построении последовательность, кодирующая сигнальный пептид оерА предшествует полной последовательности проапо А - 1 без кодона АТО (фиг, ба, б, с).Трансформанты Е, со 11 эатем подвергаются испытанию на выражение человеческого проапо А - 1,6, Лостроение.вектора переноса для ввода последовательности ДНКс человеческого проапо А - 1 в бакуловирус: рЮУ 1613 (фиг. 7).Плазмида рЮУ 1613, несущая последовательность ДН К человеческого проапо А,построена путем расположения сегмента. происходящего от клона рц В 9291, ниже промотора гена полигедрина бакуловируса (фиг. 7). В данном эксперименте используется вектор переноса рАсРР 6 бакуловируса(3. Ма 1 зп 0 га и др., . Оеп, Ч 1 го 1 67. 1986 г., с1515-1529); он может быть получен из "Отделения микробиологии и иммунологии" Оттавского университета. Данная плаэмида несет промотор гена полигедрина вплоть донуклеотида - 7 в ведущей последовательности в положении 5; в ней отсутствует АТО кодон полигедрина и 170 первых нуклеотидов последовательности, кодирующей полигедрин., Желаемая точка ВаглН 155 расположена ниже нуклеотида7, Построение, иллюстрированное на фиг. 7. осуществляется следующим образом. ДН К плазмиды рАсКР 6 линейно выравнивается посредством ВавН. Кроме того, фрагмент ДНК на 810 рЬ извлекается из ро В 9291 путем выравнивания с ограничительными ферментами АЯр 718 и ЯА, Данный фрагмент кодирует человеческий проапо А- и содержит кодон АТ 6 инициирования трансляции. Эти два фрагмента в равномолярных пропорциях совместно обрабатываются ДНК полимеразой Т 4, сшиваются посредством ДНК лигазы Т 4 и используются для трансформации компетентных клеток штамма АВ 58 Е. со, Данные трансформанты отбираются на их стойкость к ампициллину, просеиваются посредг-вом 35 - мерного синтезированного олигонуклеотида, меченого 32 р (смотри рис. 2), соответствующего части ДНК последовательности проапо А - , и осуществляется их контроль путем ограничительного анализа для проверки правильной ориентации данной последовательности ДНК проапо А- относительно промотора гена полигедрина. Одна из трансформант несет рекомбинантную плазмиду, рЮУ 1613, которая отвечает данному условию; она используется в анализе данного выражения.7. Продуцирование человеческого проапо А- трансформированными микроорганизмамиКультуры, состоящие из 20 мл штамма АЙ 58 или 1 М 101 Е. со, трансформированные соответственно ро В 9291 и рО 89296, культивируются в обогащенной среде, дополненной 50-ю мкг/мл ампициллина (культурный бульонВ, смотри Т. Мапатз и др., приведено выше, для проведения экспериментов) до тех пор, пока не достигается оптическая плотность от 0,6 до 630 нм, В случае рц В 9291 индукция,промотора лямбда Р осуществляется с созданием исходных условий роста культуры от 30 С до 42 С, таким образом, что происходит инактивация подавителя промотора лямбда Р. (М. ВогепЬег 9 и др,. Мейобэ Епгуво 101, 1983 гстр, 123-138. Индукция,происходит в течение 20 минут,В случае рц В 9296 индукция промотора ас осуществляется с вводом в культуру, инкубированную при 37 С, химического индуктора РТО изспропил-бета-тиогалэктозид) до тех пор. пока не достигается конечная концентрация 1 мМол (В.огемец и дрприведена выше), Индукция происходит в течение 60 минут. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 С другой стороны, культуры, состоящие из 20 мл дрожжевых клеток 10544 с, трансформированных рц В 9299, культивируются при 30 С в среде азотированного основания для дрожжей(Осо), дополненных глюкозой (10 Д), до тех пор, пока не достигается оптическая плотность 0,3 - 630 нм. Нет цеобходимости ни в одном индукторе, поскольку в данном конкретном случае данное выражение является основным.Отбираются образцы из 1 мл указанных выше культур и центрифугируются при 15.000 9 в течение 5 мин. Полученные осадки лизируются в кипящем додецилсульфате натрия (ОЯЯ). Эти скопления переводятся в суспензию в 50 мкл буфера, содержащего 055, (50 мМол Трис-НС, рН = 6,8, 2;ь 055, б Мол, мочевины, 50/. 2-меркаптоэтанола и 10 глицерина) и данная суспензия нагревается при кипении в течение 3 мин при 100 С. Затем экстракты центрифугируются при 15.000 д в течение 10 мин, Эти образцы готовы, таким образом, для анализа путем электрофореза на полиакриламидных гелях концентрацией 15; или 7,5 ь в присутствии 055, в денатурированных условиях О,К,аевв, указано выше).После электрофореза полиакриламидные гели быстро промываются 40 миллилитрами дистилляционной воды и 40 миллилитрами буферного раствора фосфата натрия 50 мМол) с величиной рН 7,5. Затем эти белки электрически переносятся с гелей на нитроцеллюлозный лист в течение двух часов при б 0 Вольтах и 1,5 Амперах в том же буферном растворе фосфата (Т, СаЬееоп и дрсм. выше). Нитроцеллюлозные листы насыщаются альбумином (10) в 50 мМол буферного раствора фосфата натрия с величиной рН = 7,5, затем они инкубируются при комнатной температуре в течение ночи и в присутствии сыворотки кроличьего античеловеческого апо А -при разбавлении 1/500 и в случае ро В 9296 в присутствии моноклональных антител анти-бета-галактозидазы мыши) в том же буферном растворе, лишенном ал ьбумина.Данные листы пятикратно промываются 40 миллилитрами того же фосфатного буферного раствора и затем инкубируются в 40 мл фосфатного буферного. раствора, содержащего 10 мкг/мл сыворотки козьего анти-антитела кролика (или анти-антитела мыши) и подвергаются мечению в пероксидазе, После четырех часов инкубирования при комнатной температуре данные листы снова пятикратно промываотся в 40 мл фосфатного буферного раствора и окончательна проявляютсч путем ввода 50 мл растворахромогенного субстрата (10 мг диаминобеизидииа. 100 мкл перекиси мочевины концентрацией 10 .и 100 мМол Трис-НО с величиной рН 7,6), В случае ро В 9291 и рц 89299 обнаруживается уникальный продукт, реагирующий с антителами анти-человеческого апо А - 1. Этот продукт имеет молекулярный вес, соответствующий молекулярному весу эталонного естественного апо А, В случае рц В 9296 обнаруживается слитый полипептид размером, предусмотренным для суммы бета-галактозидазы полипептидов и проапо А144 кДа), реагирующий с сывороткой человеческого анти- зпо Аи с сывороткой анти-бета-галактозидазы, Эти размеры определены предварительно с помощью калибровочной кривой, основанной на миграции эталонов молекулярного веса, находящихся на тех же гелях, что и клеточные экстракты,В другом эксперименте культуры 20 мл слоя ЗА 221 Е, соИ трансформированные рйт 1612, культивируются в обогащенной среде, дополненной 50 мкгмл ампициллина (питательный бульонВ, смотри Т, Мап 1 аОз и друказано выше) до тех пор, пока ие достигается оптическая плотность, равная от 0,6 до 630 нм. Индукция промотора ас осуществляется путем ввода в культуру, инкубироваиную при 37 С, химического иидуктора РТО (изопропил-бета-тиогалактоэид) до тех пор, пока конечная концентрация не будет равна 2 мМбл. Индукция осуществляется в течение 60 минут, Отбираются образцы этих культур в количествемл и осуществляется центрифугирование при 15000 9 в течение 5 мин, Полученные осадки собираются посредством небольшого оемотического воздействия с целью освобождения периплазмовой фракции (О. КозЫапб и О. Во 1 зте 1, Се 1, 20, 1980 г, 749-760). Освобожденная фракция переходит в суспензию в буферном растворе образца, содержащем 083, упомянутый выше, но не содержащем мочевины, суспензия доводится до кипения, центрифугируется и подвергается электрофорезу на полиакриламидном геле концентрацией 12,5 в присутствии 058 с последующим иммунодетектировзнием после электрофоретического переноса, Фракция синтезированного проапо Аобнаруживается в данной клетке. но ие в периплазме. Это обусловлено либо тем фактом, что проапо А- не секретируется, либо тем фактом, что эффективность осмотического воздействия не является оптимальной. Основная фракция проапо Аобнаруживается в свободном состоянии в данной среде после осмотического воздействия, указывая таким образом на то, что белок хорошо секретирован клетками.8, Продуцирование человеческого проапо Аклетками насекомых, зараженных бакуловирусомРекомбинантная плазмида рй 1 У 1613используется совместно с диким штаммом бакуловируса для совместного заражения клеток Яробор 1 ога 1 гц 91 регба в культуре,Выборка рекомбинаитных вирусов. лишеннных полигедрина, дала в результате рекобинаитные колонии, Рекомбииантный вирус, очищенный от колонии, используется для заражения клеток насекомых, Эта про 15 цедура хорошо известна для специалистовв данной области и подробно описана М,О.Яигпеег и 6.Е. ЯпЮ "Справочное руководство по методам для бакуловирусных векторов и операциям для клеточных культурнасекомых", Техасский Университет, Колледж Стэйши, 1987 г,Этот рекомбинантиый вирус испытан иапродуцироваиие проапо Аиммунологическим способом после электрофоретическогопереноса и способом электрофореза на полиакриламидном геле концентрацией 12,5в присутствии 033, после лизирования клеток посредством буферного раствора й 1 РА (0,05 Мол буферный растворТрис-НО, рН - 7,2, содержащий 0,15 Мол йаС 1, 1 Тритон Х 100, 0,10 ь 053, 0,10 деэоксихолята натрия и 1 мМол фтористого фенилметилсульфоиила, ЕРМО), и обработки кипящим 033, Был обнаружен один единственный продукт, реагирующий с антителами анти-человеческого апо А. Он имеет молекулярный вес, соответствующий молекулярному весу этанола естественного апо А, и этот выраженный белок являетсяосновным составляющим компонентом общих белков. Концентрация проапо Ана 1 л культуры, измеренная путем простой радиальной иммунодиффузии (6, Мапз 1 п и др.,1 веопосйее, 2, 1965 г.,235-254) составляет примерно 100 мг9, Цитоплазматическое продуцирование человеческого проапо Ав Е. соИИспользование определенной минимальной средыДля цитоплазматического продуцирования человеческого проапо Апосредством Е, со в минимальной среде использовалась плазмида рн В 9292, Плазмида рв В 9292 была построена путем обмена фрагмента Есой 1 - Йсо плазмиды ро 1 В 9291, кодирующей промотор лямбдз Р, с тем же фраеном Есой 1 - Мсо плззмиды рОТЗ(М. Йезепбегд и др., Мейобз-Емугпо 101, 1983 г., стр, 123 - 138). Этот фрагментЕсой - Исо вектора рОТЗ (6. Бечаге и др., Се, 36, 1984 г, с. 43-49) содержит также эффективный и регулируемый промотор Р, фага лямбда. Он выращивается в определенной минимальной среде культур 20 мл штамма АЙ 58 Е. соИ, трансформированного плазмидой рц В 9292. Состав минимальной среды (на литр) следующий: 3 г Ма 2 НРО 4 2 Н 20, 3 г. КН 2 РО 4, 0,5 г йаС 1, 1 г ИН 4 С 1, 1,37 мМол М 9504 7 Н 20, 29,5 мкМол, ГеС 3 6 Н 20, 236 мкМол МпЯ 04 НгО, 10 г глюкозы, 1 мг витамина В 1, 50 мг ампициллина, питательный бульон культурыВ 1/20 (об/об), Клетки культивируются в данной минимальной среде до тех пор, пока оптическая плотность не достигает значения от 0,5 до 630 нм. Индукция промотора лямбда Р осуществляется путем поддержания начальных условий роста культуры от 30 до 42 С так, чтобы инактивировать подавитель промотора лямбда Р М. ЯовепЬегд и др., указано выше). Индукция осуществляется в течение 60 минут. Отбираются образцы культуры в количестве 1 мл и их пропускают в пресс Френча или центрифугируют при 15000 9 в течение 5 мин. Полученный общий клеточный экстракт или осадок подвергаются обработке 055 при кипении, как описано в разделе 7, После электрофореза и электрофоретического переноса обнаруживается один единственный продукт, который реагирует с антителами - анти-человеческой Апо А-. Молекулярный вес этого продукта соответствует молекулярному весу эталонного естественного апо А-. Концентрация выраженного проаполипопротеина А- в определенной минимальной среде составляет 13,5% общих белков, либо установленная концентрация проапо А- составляет примерно 270 мг на литр культуры.10. Изеоечение. очисткз и кебзктебивинихлщ цируемога. т анс о мирсванными мик оо ганизмами 10.1, Извлечение и очистка, Осуществляют центрифугирование сырых экстрактов рекомбинантного проапо А -при 4.000 д в течение 15 мин, и осадок извлекают. Поверхностный слой центрифугируют при 100 000 9 в течение двух часов. Полученный осадок переводят в суспензию в минимальном объеме буферного раствора (ТЕт 100), содержащего 20 мМол, Трис-НС, рН = 7,5; 1 мМол этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЕДТА), 100 мУол ИаС; 1,75 мкг/мл РРМЬ и 100 мкг/мл мертиолат натрия (натриевая соль этилртуть-тиосалицииловой кислоты), и укаэанные объемы суспензии и всплавшего слоя отдельно другот друга доводятся до начального объема экстракта посредством того же бу 4 ерного раствора. Затем белок осаждается из обеих суспензий при увеличивающихся концентрациях изопропилового спирта. Мегодом радиальной иммунодиффузии (6, 1 Лапеи и друказано выше), используя промышленный эталой апо А-, определяют фракцию осажденного белка каждой суспензии, которая составляет основную часть иммунореак 5 10 в качестве элюента. Собирают фракции объемом 0,9 мл, и методом радиальной иммунодиффузии в каждой фракции определяют количество общего белка, имеющего иммунореактивность, соответствующую иммуно 20 реактивности апо А-. Молекулярный вес белка, элюированного в данных фракциях, определяется путем калибровки колонки с помощью эталонов с известным молекуляр 25 ным весом, таких как альдолаза, альбумин бычьей сыворотки,яичный альбумин, химот- . рипсиноген и цитохром С, в идентичных условиях, Чистота проапо А- на мг общего белка в основных фракциях, содержащих рекомбинантный проапо А, выраженная в мг белка, ймеющего ту же иммунореактивность, что и промышленный эталон апо А - , составляет 95 ф 0,0 2, т,ениа10.2,1, Физические сеоистес. Ое бинантнжа пррапа.Ь - .При центрифугировании при 100 000 9 рекомбинантного проапо А-, очищенного и изолированного от поверхностного слоя и осадка, о изоэлектрической фокализацией согласно способу М. Са 1 зпрооаэ (Апа. ВосЬегп, 26, 1969 г., стр. 54 - 62) и с применением аутогенерированного градиента с величиной рН от 4 до 6, получается одна единственная полоса с изоэлектрической точкой 4,95. Плазматический апо А -является немного более кислотным и имеет изоэлектрическую точку 4,75. Это различие в величине рН равное 0,2 между изоэлектрическими точками рекомбинантного апо А- и плазматического апо А- очень близко по значению уже известному различию между изоэл 1 ектрическими точками плазматического апо А-, которое. как уже сообщалось ранее, равно 0,17 ОЛ., Мэ и др.,аЬ. ТесЬ. В ос Ьегл, 1 Ло . В о 1, 14, 1984 г., стр, 244-245).Ч то касается молекулярного веса, то рекомбпнантные проапо А- осадка и поверхностного слоя оба состоят из одной 30 35 40 45 50 55 ком тивности, соответствующую человеческому апо А - . Полученная таким образом каждая фракция далее очищается методом хроматографии в колонке с ЗерЬасгу 5200, с ис. пользованием того же буферного раствораединственной полипептидной цепи идентичного молекулярного веса равного 29,9+ +1,4 кДа. Человеческий плазматический апо Аимеет несколько меньшую длину цепи и его молекулярный вес равен 29,3 +1,3 кДа.10.2.2. Оп ле е пептидиоа картЫб.ГяипР : .2.м.м 61 РЗскатола,Осуществллетсл химическое расщепление посредством 3-бром-метил-2-нитрофенил)тио)-ЗН-индола (ВАРЯ.скатола) согласно способу А. Гоптапа (МеФобв Емуео 1 25, 1972 г, с. 419-423). 5-10 мкг очищенных белковых препаратов растворяют в 100 мкл раствора фенола (0,15 об/об 1)ь), в водном растворе 50 (об/об) уксусной кислоты. Затем добавляют 50 мкл раствора 4,8 мг ВНРЯ-скатола на мл ледяной уксусной кислоты и инкубируют при 25 С в течение 72 ч. Затем добавляют 50 мкл 2-меркаптозтэнола и инкубируют второй рэз в течение пяти часов при 37 С, Образцы выпариваются, снова растворяются в 100 мкл воды и трехкратно экстрагируются 200- ми мкл зтилацетата. Органически фазы удаляются и водные фазы лиофилизируются и анализируются путем злектрофорезэ на полиакриламидной геле - 035.В случае химического расщепления ВЙРЗ-скатолом, число и размер фрагментов, полученных от апо А, могут быть в той или иной степени предсказанными, если принять во внимание, что в используемых экспериментальных условиях ВЙРЗ-скатал избирательно отсекается после триптофановой группы, Приняв эффективность в каждой точке расщепления за 100, наибольший фрагмент, который может быть получен, зто С-терминальный фрагмент молекулярным весом 15,4 кДа, Молекулярные веса остальных фрагментов находится в интервале от 0,5 до 5,3 кДа, и ввиду этого они 5 слишком малы для их обнаружения,В случае неполного расщепления фрагмент 15,4 кДа будет "вытянутым" в направлении Й-терминального конца, образующего соответственно фрагменты 10 молекулярными весами 20,7 кДа, 23,1 кДа,27,6 кДэ. Такие предложения вполне реальны для человеческого плазмэтического апо А, так же как для других очищенных препаратов рекомбинантной проапо А.15 Формула изобретенияСпособ получения последовательностиДНК, содержащей фрагмент, кодирующий человеческий проэполипопротеин А, предусматривающий получение клонов ДН К пу тем клонирования фрагмента ДНК в рВВ322, выбор клона, кодирующего препроаполипопротеин А, выделение последовательности ДНК из выбранного клона, о т л ич э ю щ и й с я тем, что, с целью обеспечения 25 наилучшей экспрессии человеческого проаполипопротеина А, клонируют фрагмент кДНК, полученный путем лигировэния ВаП - Рзт фрагмента последовательности ДНК, кодирующей аминокислоты +15 - +243 про аполипопротеина А, с синтетическимфрагментом со следующей последовательностью ДНК:. 5 - АТ 6 А 6 А САТ ТТСТ 66 СА 66 А 66 АС 6 ААССТССАСААТСТ ССТТ 666 АТА 6 А 6 ТТА А 66 АСТТ 6 - 3, ко дирующей аминокислоты от -6 до +14 полипептида и включающей кодон инициации трансляции, а также модифицированные кодоны для аминокислот -6, -1, +1, +3, +4, +5, +6, +7, +10, +11 и +14.40,ВВ,ВаВОКП а ВПКПВКааИОВПИП ДДУЪ АУ Г Т 60 АВН ФЯ -Ю Р % Ю 0 20 ХЯ В 0 Ю ЯтпОкОВккапкпаапкниВкиапВОНИВИ пкаОнкпВаО В КМ 999 ЕРРОЬРМВЙЧ КВЕА 1 УУМВЧ1 Ю Ющ Д) 1 Ю Ю ЖОО 210 29 ИИПИЮаЕВааНОВИПООИНКХПВВЦаВИВВОКОВтиЯ 3 6 Я 9 У УЗ Я Г Е 6 3 А Е 6 К 0 . й Е К Е Е 930 ЮЯ) 2 Ю 2 Ю РО Ю ЗО 300 310аЬаИИа ИПВЮКаВИКаКВНВООВВКККОНаааПОВаНПй 093 У 7 37 Г 3 КВВО 6 ГУ 1 0 ГГМВВ7% ЕО Ю ЗЮ 8 Ю В 0 350; 8 ИОБИЯБОВОЖЦ ШЮЮВЕББ У 7 КК 1 й 7926 ахв ЗЬ - 18-ье - э 5 У( ц-васе э ТСТ 6 И 66 НХ ЯС ЯС П 6 СП 6 Я 6 Я 6 ТТ Ю %А ВХ СИ Ю РА ПС СТ 6 ГК С РЬе ф 3 Ър яп СЪ 1 Офр С 1 ц Рто Рт яй Бес рго Ьр Ьзр Лгу Чв 1 Суп Лер 1 е Л(1 а)"3 -1 Ч 1 Н16 49 +12 +141111г, роиептид Зрелцй аио д- щ-сна) "исСаа б-аа 13 ,ма щ ИЬЮ-те рчи нальищ 6 метнонин 81 ее дс с 11 н 1,тои;и расцепления пропаптилааи дфиг 2 7 ЮМОБ Фиг.1точка БсЕ 7-веге 5 5 ф -- 30.Мгс 3ЯТб РСА ГАТ ТТС Т% Уб С% ВС 9 В СО ССА С М ТСТ ССТ ТГб 96 РО бТТ 1 Чб С 4 С ТРЗ 61834904 Зм.1мВ 1 КРИ 1 оапо стоп ЭКЯ Ьц.1 апо А 6диН 1 К полимера КР 1Т ЛНл полимераза Яд 1 1 открыты Н 1 цикл ) ци 1 ч О 6 051834904 А а ПОЛ БКМ аао А Рытыкплазматические концентрации апо Аи которым предшествует кодон АТ 6 иниции.НО составляют значительный факторрис- рования трансляции. Это приводит в река для сердечных припадков(инфаркт мио- зультате к тому, что полученный продукт карда) и для других заболеваний, связанных депрессии содержит й-терминальный метис атеросклерозом сосудов, В частности, му анин (соответствующий кадону АТ 6), кототации в гене, кадирующем апо А - 1, связаны рый может вызвать побочные эффекты при со снижением концентрации 1 НО, а также с его использовании в терапии,преждевременными заболеваниями кора- Изобретение касается способа палученарных артерий, Апа Аи 1.НО являются ния человеческого проаполипопротеина А - основными составляющими плазмы, кото 1, то есть зрелого белка праапо А - 1, который рые участвуют в переносе холестерина пе- способен расщепляться специфическим риферических тканей (артерий) к печени. пратеалитическим ферментам пропептида(иазываемый также обратным переносом зойапоА,Подпонятием "зрелый".испольхолестерина), экстретируясь организмам,зуемым в данном контексте, имеется в виде Принимая ва внимание то, что накопление 15 нетолькочеловеческийпроапоАкактакохалестерина в артериях является наиболее вой, но также и соответствующий белок, важной особенностью и механизмом атеро- первая аминокислота которого предстаалясклероза, стимуляция обратнога переноса ет собой метионин, и присутствие которого холестеринапосредствомапоАмажетза- обусловлено АТС кодоном инициирования медлить и преобразовать атеросклератиче трансляции в построении вектора экспресский процесс и тем самым снизить случаи сии.сердечных припадков, Благодаря данному способу получения,Созревание проапо Ав апо Аможет человеческий проапо Аполностью освоосуществляться количественна вне клетки бажден от обычных эндогенных белков и по мере нахождения в крови в течение ме других исходных материалов или продуктов. нее 12 часов. Принимая ва внимание та, чта Изобретение относится к способу полпроапо Аявляется основным, если ие учения последовательности ДНК, содержа- единственным. предаествеиникам зрелого щей фрагмент, кодирующий человеческий апо А, он может быть испальзовэи в заме- проаполипопратеина А - 1, предусматривая стительиой терапии каждый рвэ, когда сии получение кланов ДНК путем клонирования жается концентрация НО, например, при двунитевой комплементарнай ДНК в наследственных или приобретенных пора- РВЙ 322, выбор клона, кодирующего преках, Ввиду терапевтической цвести апо проаполипопротеии А - 1, выделение после- А, исследователи делали попытки разра- давательности ДНК из выбранного клона и ботать способы, позволяющие продуциро характеризуется тем, что в целях обеспечевать агю Ав больших количествах. Такие ния наилучшей экспрессии человеческого общеизвестные способы включеат очистку прааполипопротеина А, при помощи ДНК апа А, подученного в кровяной плазме, - лигазы Т 4, связывают фрагмент ДН К Ва 1 1Из публикаций (Р. СЬеоп 9 и 1, Снап, - Рзс 1 кодирующийаминакислотыс+15 по Мцс 1 е 1 с Ас 1 бз Вез 11, 1983 г., 3703-3715; 40 +243 препроаполипопратеина А, в конце Л. Яе 11 Ьаяег и дрОМР, 3, 1984 г., 309-317, синтетического фрагмента, имеющего пои японская патентная заявка В 9699886) следовательность ДНК (указана одинарная известна, что комплементарная ДНК, кади- цепочка):рующая препроапо Р, может быть получе-АТОДОДСАТТТСТ 66 СА 6 СА 66 АС 6 на способами генетики. 45 ддССТССдсддТСТССТТ 666 дтдбд 6 ТТдТак, й, 1 огеме(б и др. (РЕВЯ 1 ей 194, А 66 АСТТО - 31986 г 343-346) показали, что апо дмо- кодирующую аминокислоты с -6 до+14 полжет быть экспрессирован в Е. со 11 в форме ипептида и содержащую кодаи инициэции белка, слитого с нерасщепляемой бета-га-трансляции и модифицированные кодоны лактозидазой. Однако попытки экспресси для аминокислот -6, -1, +1, +3, +4, +5, +6, +7, ровать зрелый апо Ав форме неслитого +10,+11 и+14,Паследовательностьмодифибелка остались безуспешными. В японской цированной ДНК, полученной. согласно патентной заявке М 9699886 описывается способу настоящего изобретения. находит экспрессия белка подобного человеческому важное применение в конструировании векаполиполротеину А, е Е. сор которнй оо тора клонирования и акспрессии, содержа- трансформируется плавмидой рндЕ-, со. щего агу последовательность ДН К, держащей ген со структурой апо А - 1, под кодирующую человеческий проапо А, что контролем промотора щ, Однако данный дает амплификацию, а, следовательно, эксструктурный ген является неполным и со- прессию зрелого человеческого проапо Астоит из кодонов аминокислот от+4 до+243, и мет-проапо Р - 1; его конъюгатов слияния1834904 ал ОМ сой 1 Проапо А1834904 Аф 1 Составитель Н.КузенковТехред М,Моргентал Корректор М.Керецма Реда кто Подписноеизобретениям и открытиям при ГКНТ ССС, Раушская наб., 4/5 роизводственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 аказ 2705 ТиражВНИИПИ Государственного комитет113035, Москва, Ж АзР 71Ьд Тб проапо Астопили ео коньюгатов с й-концевым сигналом, культурами жизнеспособных клеток или генетически модифицированных микроорганизмов,. содержащих такие векторы, и способных продуцировать полипептиды человеческого проапо А - 1 в физическом состоянии, отличном от того, который обнаруживают или выделяют из. источника или естественного окружения. Полученный человеческий проапо А - 1 в значительной мере освобожден от обычных эндогенных белков и других исходных материалов и продуктов.Белок, продуцируемый клетками или микроорганизмами, модифицированными последовательностью ДН К, полученной согласно способу настоящего изобретения, состоит из или содержит зрелый человеческий проапо А - 1, который в таком случае может быть превращен в условиях 1 п ащ иеи (п ннр а крепли челоееческии ало А- путем протеолитического действия апо А - 1 и ропе птидазы. Получен н ый человеческий проапо Аможет быть использован как таковой в терапевтических целях; может быть также использован мет-проапо А - 1, если присутствие метионилового радикала фармацевтически приемлемо, т.к. данный продукт может быть естественным образом и эффективно превращен в ток циркулирующей крови натуральной пропептидазой, в аутентный зрелый человеческий апо А - 1, При желании, человеческий проапо Аможет быть продуцирован в отобранных микроорганизмах или клеточных культурах, которые способны воздействовать на М- концевой метионин, и, следовательно, способны продуцировать человеческий проапо Ав форме, не содержащей М-концевой метионин. Другими словами, человеческий проапо А - 1 содержит или не содержит 1 чконцевой метиониловый радикал, может быть расщеплен в условиях а ч 1 тго с обра зованием зрелого человеческого апо А, который может быть использован в терапевтических целях. Это же относится и к коныюгатам слияния и коньюгатам, включающим сигнальный К-терминал проапо А; расщепление этого продукта приводит к образованию аутентного человеческого апо А - 1, лишенного И-концевого метионина.Установлено, что эффективная экспрессия может гарантироваться за счет соответствующей модификации некоторых кодонов в последовательности, кодирующей аминокислоты от -6 до+14 человеческого проапо А - . Понятие "соответствующая модификация" в данном контексте означает, что некоторые естественные кодоны заменяются другими кодонами, которые, согласно гене структурой проапо А - 1, которому предшествует кодон АТС, и который находится под контролем промотора РЬ фага лямбда. Эти плазмиды представляют собой векторы экспрессии, которые пригодны для Е. со и 50 направляют синтез человеческого проапо А, который может быть расщеплен пропептидазой с образованием зрелого аутентного человеческого апо А - 1. При вводе в -.55 со плазмида рц В 9296 направляет зкспресслитого белка, содержащего бета-галактозидазу и человеческий проапо А, под контролем зоны стимулятора 1 ас, Е, соИ, Если учесть то. что данный продукт слияния содержит еще последовательность расщептическому коду, предстэвляют собой те же аминокислоты и, кроме того, это понятие означает, что все взятые совместно модификации приводят к снижению или даже к пол ному устранению образования булавочныхструктур. Следует подчеркнуть, что такие модификации последовательности ДНК не оказывают никакого влияния на тип точки расщепления пропептидазы ввиду того, что аминокислотная последовательность, распознаваемая пропептидазой,сохраняется в данном построении.Продуцируемый белок, является продуктом культуры клеток или генетически мо дифицированного микроорганизма и можетбыть представлен в форме зрелого проапо А - 1, в форме зрелого проапо А - 1, которому предшествует радикал метионина, в форме слитого белка, такого как, например, бета галактозидаза-проапо А, и в форме соединения препроапо А.Культура клеток или микроорганизмов,используемые для данного продуцирования, не ограничиваются клеточными линия ми и специфическими организмами; могутиспользоваться как прокариотические клетки, так и эйкариотические клетки, включая линии клеток животных и человека, Лишь с целью иллюстрации ниже дается пример 30 экспрессии в бактерии Е со 1 как представителя прокариотических клеток) и в дрожжах Басслатотуоаа СаГчвтс, а также а клетках насекомых, зараженных бакуловирусом (как представителей эйкаристических 35 клеток).Реплицируемыми векторами клонирования и векторами экспрессии, содержащими последовательность ДНК, полученную согласно изобретению, и используемыми в 40 примерах являются рекомбинантные плазмиды РО В 9291, ро 1 89292, рц 1 В 9296, рц 1 В 9299, рИУ 612 и рИ т 1613, построение которых будет представлено ниже. Первые названные плазмиды, рц 1 В 9291 и рц 1 45 В 9292 содержат ген с модифицированнойпения пропептидазы, то он может быть расщеплен с образованием аутентного зрелого человеческого апо А-.1.Плазмида ро В 9299 представляет собой вектор экспрессии, пригодный для дрожжей и содержащий зоны промотора и терминатора транскрипции АВ(Д, позволяющий гарантировать эффективную экспрессию в дрожжах, Полученный человеческий проапо Аможет быть снова расщеплен пропептидазой с образованием аутентного зрелого человеческого апо А,Плаэмида рй 1 У 1612 содержит ген со структурой проапо А-, слитый с последовательностью ДНК сигнального пептидэ белка ОгпрА Е, соП и под контролем промотора 1 оо (лииопротеина) и промотора-оператора 1 ас. В данном построении последовательность, кодирующая сигнальный пептид оврЬ предшествует последовательности проапо А- без АТ 6 кодона инициирования трансляции, Эта плазмида представляет собой вектор секреции подходящий для Е, со 1 и направляет синтез человеческого проапо А, который может быть секретирован в периплазме без И-терминального метионина, Плазмида рй 1 У 1613 представляет собой вектор переноса для ввода последовательности ДНКс человеческого проапо Ав бакуловирус. Она включает полигедриновый промотор бакуловируса и ген со структурой проапо А, включая АТО кодон инициирования трансляции.Совместно с естественным источником бакуловируса (вирус ядерного полигедриозиса АоЖ 9 гар)а са 10 огп 1 Сэ Асй РК), плазмида рИ 1 У 1613 направляет синтез проэпо А - 1 в клетках насекомых и может снова освобождаться от метионина после пост-трансляционных модификаций в клетках насекомых.В зависимости от типа используемого вектора и от выбранного хозяина может ис. пользоваться любой прием генетики, пригодный для достижения желаемой генетической модификации. включая трансфекцию, трансдукцию и др,Данное изобретение осуществляется со штаммом ММ 294 микроорганизмаЕ, со 1 К 12 (аЫо АЩ, ЬасЯ, зцр Е); этот штамм был сдан на хранение был сдан на хранение в Коллекцию культур американского типа (АТСС М 33625) без ограничения в отношении его доступности.Тем не менее. могут быть использованы другие микробные щтэммы, включающие известные щтаммы Е со 1 К такие кэк 1-;ааЦ В, Е сай х 1776 (АТСС М 31537, депонирован 3 июля 1979 года, без ограничения),Я.сои АД 88. производное от М ЯЯ 1 АТСС сзг40 пликации для обеспечения гарантии амплификации в хозяине. Эта гетерологическая вставка может быть снова экспрессирована таким образом, чтобы получить экспрессию одновременно с предыдущей слитой последовательностью, происходящей, например,от генов системы 1 эс,Эти векторы экспрессии бакуловируса, например рАсЯР 6 и рАсУМ 1 (,1, Мэ 1 зщ)га идругие. 1, Оеп. н 1 го 1, 68, 1987 г., стр. 12331250) и бакуловирус дикого типа (вирус ц Р" " мР Йммеьь св 11 Уогп)рд Асс)РУГ) широко используются в настоящее время. Они подробно описаны в литературе и могут быть получены в основном согласно способу, используемому на Техасской экспериментальной сельскохозяйственной станции.8 качестве хозяина можно использовать также различные клетки насекомых для совместимых векторов экспрессии, напри 33956) с с 1, с 1 857, Ь 1 о функции дельта Н, лишенные лямбда, поставляемый Р 1 - РНАЙМАС 1 А УЕМО и дрРгос. Йп 1. Асад Яс 1, США, 82, 1985 гстр. 88-92; 6 Оечаге и Б дрСе 11, 38 1984 г., стр, 43-49), Е, со 11 1 М101(АТССТФ 33878) 11. Мевв 1 пр и др Ыос 1 ев Ас 1 бз Вез 9, 1981 г., стр. 309 - 321), или Е, со 1 . А 221(1 рр-. ЬэсМ+. игр Е 5, 1 еи В 6,1 ас У, гес А 1 УГ, 1 ас 1, 1 ас+, рго+) (.1. ОЬгауеЬ и др., 10 ЕМВО Лб 3, 1984 гстр. 2437 - 2442), илидругие микробные штаммы, многие из которых депонированы и доступны согласно положению о депонировании известныхмикроорганизмов, таких как микроорганиз 15 мы культур американского типа (АТСС) --смотри перечни каталога АТСС, Эти микроорганизмы включают, например, Вас 1, такие как Ваз 1 оз зоЬ 1111 з и другие кишечные бактерии, из которых можно назвать, напри мер, Бвтопе 119 Ту 09)тог 1 от и Бвггаба)т)агсезадз с использованием плазмид, которые могут реплицироваться и выражать последовательности гетерологических ненов,Плазмиды экспрессии для применения 25 в отношении бактерий, например, Е. сд,обычно получаются из плазмиды рВЯ 322, используемой в качестве вектора (депонирована в АТСС под номером 37017) и путем вставки соответствующим образом после довательности гетерологического гена одновременно с сигналами инициирования и завершения трансляции, в фазе считывания, точно соответствующей функциональному промотору, с преимущественнымотбором естественных или искусственно образованных ограничительных точек, Данный вектор будет являться носителем одного или нескольких характеристических генов отбора по фенотипу и источника ре 1834904 10мер клетки Едободтвга ггид)регда 819 дч),17, Ядгпгпег и О.Е. 5 гпЮ, Справочное руководство по методам для векторов бакуловирусов и по обработке клеточных культур насекомых, Техасский университет, Колледж Стэшн, 1987 г., АТСС СК 1 1711).Могут быть использованы различныештаммы дрожжей, заключающие в себе совместимые векторы экспрессии, такие как плазмида УВ р 7 (Р,Т, Ят 1 псйсоаЬ и др., йашге, 282, 1979, стр. 39-43), которая способна к отбору и репликации одновременно в Е, со 1 и в дрожжах, в частности, бассбвгошусев сегеч 1 в)ас.Штаммы дрожжей, которые могут быть использованы, представляют собой штамм РН 218 (6. М 1 оыаг 1 и дрЗ, ВастегО 1, 134;1978 гстр. 49 - 59), депонированный в Коллекции культур американского типа без ограничения (АТСС М 44076), штамм 10 Я 44 с (Т. СаЬекоп и др., Ргос. Нас. Асас. Яс, США, 81, 1984 г., стр. 6594 - 6598), который имеет генотип 1 ео 2-3, ец 2-112, рер 4-3. (М.Ноуаегтз и др., РЕВЯ ец, 204, 1986 г., стр, 83-87) и штамм 1 с 1897 б гагд Л, )ео 2-1 брадитрофныи для аргинина АТСС сф 20631).Для экспрессии гетерологического гена, такого как ДНКс для человеческого проапо Ав дрожжах, необходимо построение плазмидного вектора, включающего четыре составляющих компонента. Первым составляющим компонентом является фрагмент, который обеспечивает трансформацию одновременно Е, сод и дрожжеи, и которыи должен, следовательно, содержать ген от.бора, происходящий от каждого организма.Это может быть ген, ответственный за стойкость к ампициллииу, происходящий от Е.со 1(см. иАгпраи) и ген 1 еи 2, происходящий , от дрожжей. Этот составляющий компонент требует также источника репликации, происходящего от каждого организма. для того чтобы сохраняться как плазмидная ДНК в этих двух организмах. Это может быть источник Е. со 1, происходящий от рВЯ 322 и источник агс) хромосомы 111 дрожжей или источник репликации круговой ДНК 2,и.Вторым составляющим компонентомплазмиды является последовательность, расположенная в положении 5 сильно экспрессированного гена дрожжей для осуществления транскрипции помещенного ниже структурного гена. Данная последовательность, расположенная в положении 5, может быть последовательностью, происходящей от генов ТОН 1 или АЙОЗ дрожжей, Этот фрагмент построен таким образом, что исключает структурные последовательности ТОНЗ или АВОЗ, которые за 5 1020 25 30 35 4050 менены последовательностью, содержащей альтернативные Ограничительные точки, например ограничительные точки Ксо или ВавНдля благоприятного связывания этой последовательности, расположенной в положении 5. со структурным геном,Третьим составляющим компонентом системы является структурный ген, построенный таким образом, что содержит одновременно АТО сигнал инициированиятрансляции и сигнал завершения трансляции.Четвертым составляющим компонентом является ДНК последовательность дрожжей, содержащая последовательность, расположенную в положении 3 дрожжевого гена, которая заключает в себе соответствующие сигналы прекращения транскрипции и полиаденилирования. Так, например, плазмиды, направляющие продуцирование человеческого проапро А - 1 в дрожжах, могут быть построены путем вставки фрагментов гена полипептида человеческого провора Ав точку 8 дш Н 1 плаамиды выражения р 81710774.описанной вевролеяскои патентной заявке М 151102.Дополнительные отличительнь)е особенности настоящего изобретения будут ясны из последующего описания предпочтительных построений векторов, включающих последовательность ДНК, отвечающей данному изобретению, и условий, в которых эти векторы могут быть полезно использованы. Далее будет дана ссылка на рисунки, в которых:На фиг. 1 а и б показана последователь-ность нуклеотидов и аминокислот человеческого препроапо А - 1. Последовательность нуклеотидов информационной РНК человеческого препроапо Аопределена, исходя из анализа ДНК последовательности ДНКс клона р, В 1609, Аминокислоты, имеющиеся в сигнальном пептиде, в пропептиде и в полипептиде зрелого апо А, идентичны и имеют нумерацию от первой аминокислотной группы белка апо А - 1. Подчеркнута область, соответствующаяотобранной пробе синтетической ДНК, используемой для выделения данного клона. Буквенные аббревиатуры, используемыедля обозначения аминокислот, имеют следующие значения: А, алании; С, цистеин; О, аспаргиновая кислота; Е, глутаминовая кислота; Р, феиилаланин; б, глицин; Н, гисти 55 дин; 1, изолейцин; К, лизин; 1, лейцин; М,метионин; И, аспарагин; Р, пролин; С, глутамии; В, аргинин; Я, серии; Т, треонин; Ч, валин;Ю, триптофан; и У, тирозин.На фиг. 2 представлена схема синтезаолигонуклеотидного адаптера для построе 1834904ния фрагмента ДНК, кодирующего 6 аминокислот пропептида и 14 первых аминокислот полипептида зрелого апо А- с АТ 6 кодоном инициирования. Стрелки показывают олигонуклеотиды, используемые для синтеза фрагмента Исоа ВАС на 66/61 основных пар (вр,),На фиг, 3 показано построение плазмиды рО В 9291, которая несет регулятарные 10 зоны лямбда Р 1 и последовательность нуклеотидав праапо А; на фиг. 4 - построение плазмиды рО В 9296, которая несет проматор ас и Е. со 1 и последовательность нуклеотидов бетагалактаэидаэы. слитой с последовательностью проапа А; на фиг, 5- построение плазмиды рО В 9299, которая несет регуляторные зоны АВ 63 дрожжей и последовательность нуклеотидов проапо А - 1; на фиг.:6 а,б,с - построение плазмиды рйт 1612, которая несет регуляторные зо ны 1 ас и щ последовательность, кодирующую Сипнппьный пептид Овр А, и последовагельность нуклеотидов праапа А - 1; на фиг. 7 - построение плаэмиды рй 1 У 1613, которая заключает в себе регуляторную зону гена полигедрина и последовательность нуклеатидов проапо А. той же обратной транскриптазы в качестве фермента. Препараты ДНКс дЬ, обычно в количестве 1 мкг, обрабатываются 9 нуклеазой, с образованием явных концов. Эти процедуры хорошо известны для специалистов в данной области и подобно описаны Мапатз и др., указывалось выше, Затем ДНКс дЬ вытягивается путем удлинения олиго (дС) согласно способу, описанному 1 Получение рибонуклеиновых кислот:Общая рибонуклеиновая кислота печени 30получается из хлористого соединения гуанидина (В.А. Сох, Методы в энзимологии,ХП, часть В, 1968 гстр. 120 - 129), Данныйпрепарат общей рибонуклеиновой кислоты(РНК) затем пропускается через колонку с 35олиго (дТ)-целлюлозой для получения общихполи А РНК (Т. Мапабаз и дрМолекулярное клонирование, Сад Ярг 1 пд НагЬа1 аЬогасогу Со 1 д Яргпд НагЬаг, Нью-Йорк,1982 г,), Из 10 граммов человеческой печени 40получается 200 мкг поли А РНК,Синтез дополнительной ДНК (ДНКс) вусловиях ин витра.Реакции обратной транскрипции, с использованием в качестве исходного продукта 0,1-5 мкг пали А РНК осуществляются сучастием олиго (дТ)12-18 (примерно 1 мкг;источник: ВОЕНВ 1 М 6 ЕВ). Затем эта однониточная ДНКс преобразуется в молекулу сдвойной нитью (ДНКс дЬ) с использованием 50 Ч 11 а - Катаган и др, (Ргос. Иа 11. Асад Зс, США, 75, 1978 гс. 3327 - 3731). Обычно осуществляется обработка 100 нг ДНКс дЬ ферментом терминальной деоксинуклеотидилтрансферазой,Обычно удлинения, соответствующие 15 основаниям, присоединяются к 3 концам молекулы ДНКс дЬ,Клонирование вытянутой ДНКс дЬ в плазмидный вектор рВВ 322,ДНК плазмиды рВВ 322 линейно выравнивается посредством фермента Рэли и вытягивается посредством удлинений олиго (д 6) согласна способу, описанному В,М.1 ааЬ и др., (йцс 1 е 1 с Асдз Вез. 9, 1981 г., стр.6103-6114).ДНКс дЬ, вытянутые удлинениями олиго (дС), смешиваются в равномолекулярных пропорциях сДНК плазмиды рВВ 322, вытянутой. посредством олиго (д 6).Обычно для рециркуляризации плазмиды гибаидизируются 50 мкг смеси. Эти условия харашо известны для специалистов в данной области и подробно описываются в работе В,М, 1 аап и др., см, выше, Затем эта смесь гибридизации используется для трансформации компетентных клеток, например, штамма ММ 294 Е. со 11, согласно способу, описанному В,М. 1 аап и др., см. выше. Несколько сотен трансформант получается путем ростового отбора в среде тетрациклина, причем стойкость к этому антибиотику сообщается плазмидай рВВ 322. Трансформанты были испытаны также на их чувствительность к ампициллину. Те аз них, которые проявляли чувствительность, содержали химеровую плазмиду, поскольку вставка инородной ДНК в вектор инактивирует ген ампициллина.йотТрансформанты Е. са 1 отсеиваются посредствам синтезированных олигонуклеотидов, меченых у конца 5 изотопом 32 Р. соответствующих фрагменту гена апа А. Такая последовательность нуклеотидов человеческого апо Ауже известна (см. Р. СЬе 1 пд и 1. Снап, см, вьше. и 1, БеВапег и др., см. выше); таким образом, осуществляют практически химический синтез по способу 1 ч.О. Япда и др, (Мцсес Ас 1 дз, Вез.12, 1984 г стр, 4539-4557) фрагмента олигонуклеотидов длиной, соответствующий 22 основаниям, соответствующих 5 концу гена. Отобранная последовательность представляет собой:5 - 6 СТ 6 С 66 Т 6 СТ 6 АССТТ 66 СС 6 - 3.Перед использованием для гибридизации синтезированной олигонуклеотид фосфорилируется у его 5 концаполинуклеотидокиназой Т 4 (Р ВосЬегп 1 са 1 з и (гамма - 32 Р) аденозинтиофосфатом. Условия мечения и гибридизациихорошо известны для специалистов в данной области и подробно описаны в работе Т, Мап 1 а 11 з и дрсм. выше, а также в работе ВоИеп А. и др(РВА, 2, 1983 гстр. 255-264).Построение плазмиды выражения, Способы получения ДНК для выделения фрагментов ДНК, а также условия анализа посредством ограничительных ферментов и условия сшивки фрагментов хорошо известны для специалистов в данной области и подробно описаны в работе ЯЛ.агап и др см, выше, и в работе Т, СаЬеуоп и др., см. выше, и применяются в настоящей работе.Синтез фрагментов КСО 1-ВаИ.На рисунке 2 показаны в деталях принципы, лежащие в основе концепции 35 - мерных, 30 - мерных, 18 - мерных и 43 - мерных олигонуклеотидов, используемых в синтезе фрагмента НСО 1-ВАИ на 65/61 основных пар (рВ). Эти сйнтезированные 30 - мерные и 18 - мерные фрагменты фосфорилируются у них 5 концов посредством полинуклеотидокинаэы Т 4 (Р -Восйегпсаз), 1 мкг каждого олигонуклеотида, включая нефосфорилированные 35 - мер и 43 - мер. гибридизируются в течение трех минут при95 С в 300 мМол ацетата натрия (рН =- 7,0); затем медленно охлаждаются при 4 С, Смесь гибридизации используется как таковая в операции клонирования для построения плаэмид выражения,Определение последовательности аминокислотных остатков ДНК,Анализ последовательности ДНК осуществляется согласно способу. описанномуА,М. Махв и И, 61 Ьеп(Ргос Мац. Асад 5 с США, 74, 1977 г., стр. 560 - 564 и Г. Бапцег и др. (Ргос, ИаО. Асад, Яс 1, США. 74, 1977 г стр, 5463-5467),Анализ белков,Скопление клеток, имеющих оптическую плотность в пределах от 1 до 630 нм (ОР 630) получали в различных этапах в процессе брожения штаммов, несущих плазмиды выражения человеческого проапо А, ро 89291, ро 89292, ро 1 89296 и ро 89299 (трансформированы соответственно вштаммах АЯ 58 и 1 М 101 Е, со 1 и в штамме10544 с дрожжей), Каждый образец переводился в суспензию в 50 мМол Трис-НС буфера, рН - .: 6 8. содержащем 2 5 10 15 20 2530 3540 45 50 додецилсульфата натрия (Рбб), б Мол. мочевины, 10 глицерина и 5 2-меркаптоэтанола, и этот буферный раствор нагревалсяпри кипении в течении трех минут, Образцы подвергались электрофореэу на полиакриламидных гелях (О.К,асгпп. Иа 1 оге 227, 1970 г, 680-685), Общие белки обнаруживались путем окрашивания синим Комассье, и синтезированный человеческий проапо А - 1 идентифицировался путем иммунологического распознавания после электрофорестического переноса (смотри А, Воеп и др см. выше).Построение рекомбинантных векторов для экспрессии человеческого проапо Ав бактериях, в дрожжах и в клетках насекомых, зараженных бакуловирусом1, Клон ДНКс для человеческого препроапо А - 1: роГВ 1609 (фиг. 1).Было отобрано несколько сотен трансформант, получаемых при клонировании ДНКс дЬ, соответствующей поли А 4 РНК человеческой печени, в точку РЫ плаэмиды рВР 322, с помощью синтезированного пробника 22 -мерного апо А - 1, описанного выше. Один из клонов дает интенсивный сигнал гибридизации в ходе выделен, и данная вставка ДНК, присутствующая в рекомбинантной плазм иде, была охарактеризована путем анализа последовательности данной ДНК, Ее длина соответствует 878 парам оснований (Ьр); она кодирует полный полипептид препроапо А. Как показано на рисунке 1, данный клонированный фрагмент ДНКс несет некодирующие зоны в 5 и 3 положениях (19 вр и 55 вр, соответственно), последовательность на 54 вр, кодирующую пептидный предшественник (от аа - 24 до аа), последовательность на 18 бр, кодирующую пропептид (от аадо аа) и последовательность на 732 Ьр, кодирующую зрелый апо А(от аа+1 до аа+243), и включает кодон завершения трансляции, Данная последовательность белка, взятая иэ последовательности ДНК, абсолютно точно соответствует обнаруженным аминокислотам для препроапо Лиз данного белка и иэ клонов ДНКс, выделенных изолированно друг от друга (В/.С, Ма"1 ег и др., Соп;р, Вослеп, РЬуво 1 578, 1977 г., стр, 309-315; Патентная заявка Японии Кг 96998/86; Р. СЬеоп 9 и. СЬап, см. выше, и,). беВагпег и дрсм, выше).2, Построение бактериального вектора экспрессии, включающего последовательность ДНКс человеческого проапо А: рц 89291 (фиг, 2 и 3),Была построена ро 89291, плазмида, нродуцирующая человеческий праапо А- путем расположения сегмента. происходящего от клона рО( 81609, за регуляторным промотсром лямбда Р (рис, 3), Построение этой плаэмиды экспрессии требует сингезафрагментов ДНК, включающих ограничительную точку ЯЯЦТО кодон инициирования трансляции и последовательность нуклеотидое, кодирующую аминокислоты от аминированного конца гена со структурой человеческого проапо А, до первой уникальной ограничительной точки, ВаИ (фиг, 2),Такой адаптер синтезируется химическими методами (М,О. 81 пЬа и др., см. выше), Получено четыре синтезированных олигонуклеотида; после гибридизации они кодируют метионин, соответствующий АТО кодону инициирования трансляции, для шести аминокислот, соответствующих пропептиду, и для 14 первых аминокислот зрелого ,человеческого апо А - 1 (рисунок 2). Этот синтезированный адаптер служит для снижения до минимума образования вторичных структур у конца 5 гена. Для этого кодонц, отобранные для кодирования аминокислотнцх групп -6, -1, 1, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 11 и 14, не соответствуют естественным кодонам, имеющимся в ДНКс клона рЫ В 1609,Описанный выше синтезированный адаптер используется для присоединения фрагмента ДНК на 744 рЬ, происходящего от рЫ В 1609, к промотору яямбда Р 1 в плазмиде экспрессии рЫ В 1221.Построение вектора экспрессии рц 1 81221 описано в европейской патентной заявке М 186.643. Оно включает три основных этапа, начиная от плазмиды рСОЧ . Плазмида рСОЧ 2 описана Оцееп С. в, Мо, Арр 1. Сепет,2, 1983 н., стр. 1-10, и легкодоступна,Выбор данного типа вектора необязателен: может быть использован любой другой вектор, имеющий промотор, и расположенную ниже от него подходящую точку 1 чС 01. Примерно 0,1 мкг синтезированных фрагментое, таких как описаны выше, сшиваются посредством ДНК лигазц Т 4, примерно с 1 мкг фрагмента ВаИ - РЫ на 744 рЬ, происходящего от рЫ В 1609 и примерно смкг плазмидного вектора рО В 1221, отсеченного МСО и ВаИ. До осуществления операции свивки фрагмент ВаИ - РЫ на 744 рЬ основных пары обрабатывается ДНК полимеразой Т 4 таким обра ом. чтобы происходило преобразование вытянутых концов в положении 3 в свободные концы. Данная процедура хорошо известна для специалистов в данной области и подробно описана Т. Мап 1 ат 1 з и др., см. выше,После амплификации е компетентных клетках штамма АЯ 58 Е. соИ перестроенные плазмиды характеризуются путем анализа ограничительных точек и анализа последовательности ДНК синтезированных фрагментов и точек соединения, Рекомбинантная плазмида рО В 9291 отвечает всем критериям, поскольку она имеет фрагменты в правильной ориентации и в правильном по рядке. Она используется для изучения выражения.3. Построение бактериального вектораэкспрессии, содержащего слитые последовательности, соответствующие бета-галак гозидазе и человеческому проапо А: роВ 9296 (фиг. 4).В данном построении последовательность ДНК, кодирующая человеческий проапо А, сливается в Фазе правильного 15 считывания ниже последовательности ДНКбета-галактоэидазы, Ген бетагалактозидазы присутствует в плаэмиде экспрессии Е. соИ рОВ 288, являющейся легко доступной (О, КФЬег и МоИег-НИ 1, ЕМВО .1, 2, 1983 г 20 1971-1794), которая несет эффективно индуктируемый промотор 1 ас с соответствующие ограничительные точки в последовательности бета-галактозидаэы, Была построена соответствующая рекомби нантная плазмида, как показано на рисунке4. Прежде всего ДНК плазмидц рцй 228 отсекается ВАМН 1, затем обрабатывается ДНК полимеразой Т 4 и снова отсекается 5 АИ. Затем фрагмент ДНК на 805 рЬ отделя ется от рО 1. В 9291 путем последовательныхопераций выравнивания с Крп 1, обработки ДНК полимеразой Т 4 и конечного выравнивания с Яа 11, Эти два фрагмента сшиваются друг с другом в молярных пропорциях по средством ДНК лигазы Т 4, и полученнаяплазмида используется для трансформации компетентных клеток штамма 1 М 101 ЕЕ. сф 1, который является широко распространенным и легко доступным штаммом (АТСС 1 ч.40 33876). Трансформанты характеризуютсяпутем ограничительного анализа на правильную ориентацию последовательности человеческого препро Апо отношению к гену бета-галактозидазы и на присутствие 45 воспроизводимой точки ВааЮ на стыкедвух последовательностей, Это показывает,что последовательность человеческого проапо Ахорошо слита ниже последователь ности ДНК бета-галактозидазы и в фазе 50 правильного считывания. Одна из трансфармант, содержащая плазмиду рЫВ 9296, отвечает всем критериям и используется в экспериментах на определение выражения.4. Построение алазмиды экспрессии 55 дрожжевого носителя последовательностиДНКс человеческого проапо А: рЫ В 9299 (фиг. 5).В данном построении последовательность ДНКс, кодирующая человеческий про 18349045 10 15 20 25 30 35 50 апо А-, клонируется между сигналами промотора и терминатора, которые несет плазмида выражения дрожжей. Для настоящего эксперимента выбран данный вектор выражения дрожжей рВТ 10774, Такое построение алазмиды выражения рВТ 10774 описано в европейской патентной заявке 151.102. Она построена, с одной стороны, из плазмиды рВТ 10749, депонированной в АТСС под номером 39133, в соответствии с положениями Будапештского соглашения, и, с другой стороны, из челночного вектора УЕр 13 для Е. соИ -сегечИЗ 83., описанного В. ВгеасЬ и дра бее 8, 1979 г., стр.121-133, и который хранится в ЛТСС под номером 37115 и легко доступен. Вектор рВТ 10774 может реплицироваться одновременно в Е. соИ и в дрожжах и несет промотор и терминатор транскрипции орнитинкарбамаилтрансферазы (АВОЗ), разделенных уникальной ограничительной точкой Ваш Н , приемлемой для вставки инородной ДНК, имеющей свой собственной АТО кодон инициирования трансляции. Кроме того, данный вектор несет последовательности 2 дрожжей, метаболические маркеры для отбора в дрожжах и марке отбора АтрА для челночного вектора в Е. соИ. Это не единственный вектор, который может быть использован для выражения человеческого проапо А- в дрожжах; может быть использован любой другой вектор для дрожжевого носителя рег/ляторного сигнала, и это приводит к качественно одинаковым результатам, Построение. иллюстрированное на фиг. 5. осуществляется следующим образом. ДНК плазмиды рВТ 10774 линейно вь. равнивэется посредством фермента ВагпН и обрабатывается ДНК пол имеразой Т 4.С другой стороны, фрагмент ДНК на 810 рЬ отделяется о 1 ро В 9291 путем вываривания с ферментами Азр 718 и ЗаИ, с последующей обработкой ДНК полимеразой Т 4. Этот фрагмент кодирует человеческий проапо А -и включает АТ 6 кодон инициирования трансляции. Эти два фрагмента, полученные как описано выше, сшиваются друг с другом в равномолярных пропорциях посредством ДНК лигазы Т 4, и данная смесь используется для трансформации компетентных клеток Е. соИ ММ 294, Контроль за данными трансформантами осуществляется путем ограничительного анализа, позволяющего проверить правильную ориентацию последовательности ДНК человеческого проапо А- по отношению к последовательности промотора АВ 63. Одна из трансформант содержит рекомбинантную плазмиду ро В 9299, которая пригодна для данного условия, Плазмида ро В 9299 амплифицируется в Е. соИ и используется для трансформации сферопластоя дрожжей ЯассИаговусез сегечвае штамма 10 544 с (рер 4 - 3- ец 2 - 3, ео 2 - 112) (Т, Саевроп и др., см. выше)Использование штамма 1 с 16970 (АТСС М 20631) приводит к качественно аналогичным результатам, Затем трансформанты дрожжей подвергаются испытанию на выражение человеческого проапо А-. 5. Построение ба кте риал ьного вектора секреции, включающего последовать ьность ДН Кс человеческого .проапоА-.: рЮУ 1612 (фиг. 6 а,б с).В данном построении последовательность ДНК, кодирующая человеческий проапо А - 3, сливается в фазе правильного считывания ниже последовательности ДНК сигнапкного пептида белка ОптрА Е. сор. Для данного эксперимента выбран вектор секреции рЮ -- оарА - 2 (3. ОЬгауеЬ и др., ЕМВО,3, 3, 1984 гстр, 2437-2442). Этот вектор его хозяин Е. соИ ТА 221 доступны и могут быть получены из "Отдела Биохимии Государственного Университета Нью-Йорка", Стоуни Брук,Этот вектор секреции несет сильный промотор рр (липопроте н), фрагмент промотора-оператора аг, последовательность ас репрессора ас и соответствующие ограничительные точки, расположенные непосредственно после последовательности, кодирующей сигнальный пептид гена огпрА,Подходящая рекомбинантная плазмида построена как показано нэ рисунках 6 а, в и с. В первую очередь, вектор секреции рй -- оврА - 2 линейно выравнивается с ЕсоВ и обрабатывается ДНК полимеразой Т 4, Зэтем фрагмент ДНК на 805 рЬ извлекается из ро В 9291 путем выравнивания в последовательном порядке с ограничительными ферментами Крп и ЯАИ, и последующей обработки ДНК полимераз-й Т 4, Этот фрагмент кодирует человеческий проапо А- и содержит АТО кодон инициирования трансляции. Оба фрагмента, полученные как ог 1 исано выше, сшиваются друг с другом в равномолярных пропорциях посредством ДНК лигазы Т 4, и эта сшитая смесь используется для трансформации компетентных клеток штамма 3 А 221 Е. со И, культивированных в среде М 9 (3,Н, МцИег нЭксперименты в молекулярной генетике", СоО даргпд НагЬог .аЬогатогу Сос даргп 9 НагЬог НьюЙорк, 1972 г с, 431), содержащей 20 мг/и триптофана, 20 мг/л лейцина, 2 г/л лактозы и 50 мг/л ампициллина. Эти трансформанты

Смотреть

Заявка

4356123, 26.05.1988

ЮЦБ, С. А

АЛЕКС БОЛЛЕН, ЖАН ГОБЕР, ЭРНСТ ВЮЛЬФЕРТ

МПК / Метки

МПК: C12N 15/12

Метки: человеческий, кодирующий, днк, фрагмент, содержащей, проаполипопротеин, последовательности

Опубликовано: 15.08.1993

Код ссылки

<a href="http://patents.su/22-1834904-sposob-polucheniya-posledovatelnosti-dnk-soderzhashhejj-fragment-kodiruyushhijj-chelovecheskijj-proapolipoprotein-a-1.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентов СССР">Способ получения последовательности днк, содержащей фрагмент, кодирующий человеческий проаполипопротеин а-1</a>

Похожие патенты