Способ получения ноурзеотрицина

.ЯО 139.0242 А 1 4 С 12 Р 1 06//(С 12 06,С 12 К 1:57 ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ фЛИОТЕКА ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ 2 1 лИРС 12 И/223321/(вв)Бокер, Удо Грефе,ертрауд Брадлер,Дитер Ноак (Р 0)93(088.8)ОЛУЧЕНИЯ НОУРЗЕОТРИЦИНАние относится к биокасается ферментативноноурзеотрицина - анти-сящегося к группе стрепель изобретения - снижение расхода стимулятора при ранении выхода антибиотика. Сущи ьспособа сводится к тому, что штаммБгг. поигзе 1. 1 МЕТ ЛА 3890 выращиваютв полноценной питательной среде, содержащей стимулятор антибиотикообразования - азид натрия, бренцкатехин, амиталь, сульфат цинка или5-алании, При этом стимулятор можновводить как до инокуляции питательнойсреды, так и в процессе культивирования до завершения экспоненциальнойфазы роста продуцента. Процесс ферментации ведут в аэробных условияхпри 25-30 С в течение 3-10 дней, ацелевой продукт выделяют из фильтрата культуральной жидкости. 4 табл.Изобретение относится к областибиотехнологии и касается Ферментативного получения ноурзеотрицина -антибиотика, относящегося к группестрептотрицинов,Изолированный Брадлером и Трумом(1963-1965) из культуры вариантаБйгерСощусев поигве 1 АТСС 11455 антибиотик - ноурзеотрицин дп чСго активен против грамположительных и грамотрицательных бактерий, а также про;тив микробактерий, кроме того, проявляет и противовирусное и тениацидальное действие. Ноурзеотрицин в отношении химической структуры представля.ет собой в основном смесь стрептотри,цина Г и 0 (Грефе и др., 1974).Штамм стрептомицетов, образующийантибиотик ноурзеотрицин, под названием БйгерСошусев поагве 1 МЕТ 1 А3890 Ь, хранится в коллекции штаммовЦентрального института микробиологиии экспериментальной терапии АН ГДР,Согласно известным способам (Брадлер и Трум, 1963/1965; Бокер и Трум,1966; Трефе и др., 1974) культивирование осуществляют в аэробных условиях. Для этого лиофилизированный напочве споровый материал этого штамма 30стрептомицетов пересевают на подходящие агаровые среды, После 6-10-дневоного инкубирования при 28-30 С выросший таким образом спорулирующий мицелиальный газон используют для засеважидких стерильных питательньм сред,состоящих из источников углерода иазота,. а также неорганических солей,В качестве источников углерода можно использовать различные сорта крахмальной муки растительного происхождения, например картофельный крахмал,глюкозу и/или глицерин. В качествеисточников азота используют, в частности, соевую муку различные аминокислоты и/или аммонийные соли, В начале Ферментации кислотность среды,наиболее благоприятная для антибиотикообразования, находится в пределах рН 6,0-6,7.50Глубинное культивирование микроорганизма ЗгерСошусев поцгве 1 МЕТ1 А 3890 Ь можно осуществлять в широкогорлых колбах или круглых плоскодонных колбах различного содержанияна качалке, а также в аэрируемыхстерильным воздухом Ферментаторах сперемешивающим устройством из коррозионно-стойкого материала при 2530 С, преимущественно 26-28 С, Глубинное культивирование для получениявегетативного лосевого материаладлится 24-72 ч, в частности 48 ч,а процесс выращивания главной культуры 72-144 ч,Выделение антибиотика из отделенного от мицелия фильтрата культурыосуществляется путем адсорбции к соответствующим катионообменникам, например Вофатит СР-ЗОО, и последующегоэлюирования разбавленными кислотами,(Брадлер и Трум, 1963; Грефе и др.1977.На известном питательном субстрате (Брадлер и Трум, 1985) штаммБгерошусев поигвеь 1 МЕТ 1 А 3890 Ъобразует лишь незначительные количества ноурзеотрицина (ниже 100 мкг/мл).Добавлением аминоарилкарбоновых кислот, в частности 5-10 мМ о-аминобензойной кислоты, в начале выращиваниякультуры удается в известных технических условиях увеличивать выходферментации в 5-10 раз (Бокер и Трум,1966; Трум и Бокер, 1965; Грефеи др., 1974),о-Аминобензойная кислота и/илидругие аминоарилкарбоновые кислоты(Грефе и др 1974, 1977, 1978, 1979)вызывают специфическое подавлениеобразования цитохрома а-типа (цитохромоксидаз), косвенно ингибируя темсамым как перенос аминокислоты из.питательной среды в мицелий, так иокислительное дезаминирование аминокислот в клетках ноурзеотрицинообразователя. За счет этого предотвращается вторичный обмен в связис клеточным изобилием азотных катаболитов и, кроме того, исключено, чтоаминокислоты, служащие в качествепредшественников ноурзеотрицина, взначительной степени потреблюютсяантибиотикообразователем в Фазе егороста. Таким образом, эти аминокислоты лучше доступны для вторичного обмена в ходе образования ноурзеотрицина, поскольку для образования биомассы используются преимущественно неорганические источники азота (аммонийный азот).Ферментативное производство ноурзеотрицина с использованием о-аминобензойной кислоты дозволяет значительно увеличивать выход антибиотика.Однако необходимое использованиебольших количеств аминоарилкарбоно 1390242вых кислот отрицательно влияет,наэкономичность способа в связи с затратами на такие добавочные вещества.Тепловую стерилизацию и соответственно химическую или радиационную стери 5лизацию растворов солей водных аминоакрилкарбоновых кислот нельзя осуществлять из-за разложения аминоарилкарбоновых кислот с образованием токОсических продуктов превращения, длянеобходимого обеззараживания такихрастворов остается только стерильнаяфильтрация. Последняя, однако, относительно трудоемка. Наличие аминоарилкарбоновЫх кислот в стоках хроматографических колонок затрудняетбиологическую очистку сточных вод.Цель изобретения - снижение расхода стимулятора при сохранении выходаантибиотика.Способ осуществляется следующимобразом.Задача изобретения - создание способа, обеспечивающего промышленное 25производство ноурзеотрицина без использования аминоарилкарбоновых кислот,Добавки ингибиторов дыхательнойцепи, например азид натрия или другие щелочные азиды, бренккатехин, атакже амиталь (этилизоамилбарбитуровая кислота), и/или ингибиторов переноса аминокислот в живой клетке, например водорастворимые соли цинка илибета-алании, добавляемые в главнуюкультуру в момент засева, оказываютаналогичное способствующее действиена биосинтез ноурзеотрицина, не меняябиологических свойств продукта ферментации, Необходимые для этого концентрации одного из этих веществ лежат в пределах 0,025 - 0,25 ммоль,в основном около О, 15 мм (азида натрия) или О,;5 - 1,/5 ммоль, в основном 0,50, до 0,75 ммоль (сульфатацинка или/3-аланина) или 0,052,0 ммоль, в основном около 0,4,до 1,5 мм (бренцкатехина или амиталя) .Для способа используют следующиеферментационные среды, содержащие,Е:среда Во- глюкоза 2,9; соеваямука обезжиренная 1,3; хлористый натрий 0,5; карбонат кальция 0,3; водопроводная вода для получения 100 мл,рН 6,5 (перед стерилизацией) средаВО- кукурузный крахмал 3,0; глюкоза 0,3; соевая мука обезжиренная 0,7; нитрат аммония 0,5; сульфат магния кристаллический 0,2; хлористыйнатрий 0,5; карбонат кальция 0,3;водопроводная вода для получения100 мл, рН 6,0 (перед стерилизацией),среда Во- картофельный крахмал3,2; глюкоза 2,9; соевая мука обезжиренная 1,4; нитрат аммония О;7;сульфат магния кристаллический 0,2;хлористый натрий О, 1; карбонат кальция 0,6; водопроводная вода для получения 100 мл, рН 6,0 (перед стерилизацией),Эти среды, используемые для культуры продуцента, обеспечивают гораздоболее высокий выход ноурзеотрицинапо сравнению с известной ферментационной средой,При наличии азида натрия и соответственно других щелочных азидов,бренцкатехина, амиталя, сульфатацинка и/или бетааланина, добавляемыхв питательную среду отдельно или всмеси в момент засева культуры, ноурзеотрицинообразование увеличиваетсяеще в 2-10 раз.Ноурзеотрицин можно выделить изфильтрата культуры путем адсорбциис использованием активированного угля и катионообменников (сильно- ислабокислы). Предпочтительный способоснован на адсорбции на щелочнойоснове слабакислых катионообменныхсолей. Элюирование адсорбатов проводят водными или спиртовыми растворами минеральных кислот. Из минералокислых элюатов, получают чистую сольноурзеотрицина.П р и м е р 1. Лиофилизированныена почве консервированные споры штамма ЯгерСошусея попгзе 1 1 МЕТ 1 А 3890 Ьвысевают на подходящую агаризованнуюсреду, например среду Эмерсона,Примерно после семидневного инкубиорования при 30 С вырезают из мицелиального газона участки размером 2 см 2и засевают ими культуральную среду1-й стадии выращивания следующегосостава, 7.: глюкоза 4,0; соевая мукаобезжиренная 1,5 у КНРО Ор 03 у ИаС 10,5; СаСО 0,3; водопроводная вода100 мл; рН 6,5-6,9 (перед стерилизацией).Среду в количествах по 50 мл заливают в закупоренные ватной пробкойширокогорлые колбы емкостью 500 мл.Стерилизацию осуществляют 35-минутнымонагреванием до 120 С в автоклаве.40 Засеянные культуры инкубируют на качалке при 29 С в течение 48 ч. 3 млпосевного материала используют длязасева Ферментационной среды.Для ферментации используют следующие питательные среды, %: средаВо- глюкоза 2,9; соевая мукаобезжиренная 1,3; ИаС 1 0,5; СаСОЗводопроводная вода 100 мл; рН 106,5 (перед сгерилизацией), средаВо- кукурузный крахмал 3,0; .глюкоза 0,3; соевая мука обезжиреннаяОэ 7; ИН ИО 0,5; МАМБО 7 Н 0 О, 2;МаС 1 0,5; СаСО 0,3; водопроводнаявода 100 мл; рН 6,0 (перед стерилизацией) .Ферментационные среды в количествах по 80 мл заливают в закупоренныеватной пробкой широкогорлые колбы 20емкостью 500 мл и стерилизуют при120 С в течение 35 мин в автоклаве.К предварительно подготовленнойпосевной культуре в момент засеваприбавляют стерильно профильтрованные 25водные нейтральные растворы соответствующих веществ (максимум 3,0 млдобавки/80 мл среды),В табл, 1 и 2 приведены средниемаксимальные концентрации ноурзеотрицина, полученные в течение 72-100 чинкубирования культуры продуцентомпри 26 С методом диффузии в агар сиспользованием Васг 11 цз зцЬг.11 вАТСС 6633 в качестве тест-микроорга 35низма.П р и м е р 2Вегетативный посевной материал Бг, поцгяе 1 выращивают,как описано в примере 1. По 10 мл48-часовой культуральной жидкостииспользуют для засева 2-й посевнойсреды. Эта среда имеет такой же состав, как и среда 1-й стадии, и еестерилизуют таким же образом.Среду в порциях по 400 мл заливаютв закупоренные ватной пробкой широкогорлые колбы емкостью 2500 мл. Посеовы инкубируют при 29 С в течение 24 чна качалке. По 800 мл получаемого таким образом посевного материала 2-йстадии выращивания используют длязасева стерильных ферментационныхсред, залитых в количествах по 20 лв заранее термостерилизированныестеклянные ферментаторы емкостью30 л каждый, Для этого используют55указанные в примере 1 среды Во и Во, которые дополнительно содержат еще 0,37. подсолнечного масла в качестве пеногасителя. Непосредственно после засева добавляют стерильнопрофильтрованные водные нейтральныерастворы приведенных в табл, 3 веществ (максимум 200 мл добавок/20 лсреды) .Ферментационные среды инкубируютв течение 120 ч при 26-28 С и коэффициенте аэрации 20 л воздуха/мин(при нормальном давлении) при перемешивании (440 об/мин). В качествепеногасителя в случае необходимостииспользуют стерильное подсолнечноемасло.Образуемый в процессе Ферментацииноурзеотрицин ежедневно определяютмикробиологическим способом, как описано в примере 1,П р и м е р 3. Вегетативный посевной материал Бгг. поцгзе 1 выращивают таким же образом и с использованием такой же питательной среды, какописано в примерах 1 и 2.С помощью восьми полученных выращиванием на качалке 24-часовыхкультур 2-й стадии засевают 150 лтермостерилизованной среды (60 минпри 125 С) описанного состава, залитой в Ферментатор из благородной стали (общая емкость 200 л), оснащенныйустройствами для подачи стерильноговоздуха и перемешивающим устройством,Культивирование осуществляют при26-28 С, скорости работы перемешивающего устройства 375 об/мин и коэффициенте аэрации 1 л воздуха и 1 лкультуральной жидкости/мин (при норемальном давлении).После 20-24 часового инкубирования используют 100 л этой культурыдля засева 600 л Ферментационнойсреды. Эта среда заранее простерилиозована 1-часовым нагреванием до 180 С(общая емкость 1000 л; имеются устройства для перемешивания, подачистерильного воздуха и регулированиятемпературного режима).Используемая для этого питательнаясреда Воимеет следующий состав,Е:картофельный крахмал 3,2; глюкоза2,9; соевая мука обезжиренная 1,4;нитрат аммония 0,7; сульфат магниякристаллический 0,2; хлористый натрий О, 1; карбонат кальция 0,6; подсолнечное масло 0,3,; сульфат цинкакристаллический 0,048; водопроводнаявода для получения 100 мл,.рН 5,66, 1 (перед стерилизацией).1390242Сульфат цинка добавляют в ферментационную среду перед стерилизацией.Культивирование культуры осуществляют в течение 144 ч при 26-28 С, скорости работы перемешивающего уст 5 ройства 290 об/мин и коэффициенте аэрации 1 л воздуха и 1 л культуральной жидкости/мин (давление О, 14- 0,16 МПа).10Для пеногашения используют по мере необходимости стерильное водосодержащее подсолнечное масло. Образуемый в процессе ферментации ноурзеотрицин ежедневно определяют микробиологическим способом как описано в примере 1.Полученные результаты приведены в табл. 4.Для выделения антибиотика 500 л культуральной жидкости с содержанием ноурзеотрицина 4000 мкг/л подкисляют щавелевой кислотой до значения рН 4,0 и сепарированием отделяют от твердых веществ. Затем фильтрат нейт рализуют 307.-ным водным раствором МаОН и вновь сепарируют для отделения дополнительных продуктов Флокуляции. Для адсорбции антибиотика нейтрализованный Фильтрат культуры фильтруют со скоростью протекания 70 л/ч через колонну, заполненную 70 л Вофатита СР(натриевая Ьорма). Адсорбат промывают 50 л деионизированной воды, затем О, 1 н. уксусной кислотой до кислотности рН 5,5 протока и еще 15 л воды. Элюирование антибиотика осуществляют 50 л 1,0 н. НС 1 и затем деионизированной водой, причем элюат принимают раздельно в двух фракциях:40 фракцию 1 до перехода элюата в сторону кислых значений, а фракцию 11 в качестве кислого элюата. Нейтральную фракцию .1 (около 50 л) выпаривают до патоки непосредственно в вакууме при температуре максимум 40 С (около 4 л). Этот остаток растворяют в 60 л метанола, После фильтрации метанолового раствора при перемешивании порциями прибавляют всего 260 л ацетона, осаждают ноурзеотрицин-гидрохлорид. Осадок отФильтровывают, промывают 13 л смеси метанола:ацетона (1:3; Ч:Ч) и затем еще 8 л абсолютного ацетона и сушат в вакууме над концентрированной серной кислотой или пятиокисью фосФора.Получают 740 г белого аморфного ноурзеотрицин-гидрохлорида с содержанием ноурзеотрицина 950 ед/мг и 5,4/ сульфатной золы,К солянокислой фракции 11 5 л прибавляют порциями при перемешивании анионообменник Бофатит 1 -150 (ОН-форма) до нейтральной реакции раствора. После отфильтровывания ионообменника фильтрат концентрируют и обрабатывают как и фракцию 1, причем используемые качества растворителей соответственно уменьшены.Получают 100 г белого аморфного ноурзеотрицин-гидрохлорида с содержанием ноурзеотрицина 500 ед/мг и 10,07. сульфатной воды. Формула изобретения Способ получения ноурзеотрицина путем культивирования штамма ЗТгерошусез поцгзе 1 МЕТ 1 А 3890 в жидкой питательной среде, содержащей источники углерода и азота, минеральные соли и стимулятор антибиотикообразования, в глубинных аэробных условиях при 25-30 С в течение 3- 1 О дней с последующим выделением целевого продукта из фильтрата культу- ральной жидкости, о т л и ч а ю - щ и й с я тем, что, с целью снижения расхода стимулятора при сохранении выхода антибиотика, в качестве стимулятора антибиотикообразования используют 0,025-0,25 ммоль азида натрия, 0,05-2,0 ммоль бренцкатехина или амиталя, или О, 15-1,75 ммоль сульфата цинка или ф-аланина, при этом стимулятор вводят либо непосредственно в питательную среду до стерилизации, либо в процессе культивирования до завершения экспоненциальной Фазы роста продуцента.1390242 10 Таблица 1ж Содержание ноурзеотрицина, мкгlмл, при добавке Концентрациядобавки,ммоль бренцкатехина амит аля азиданатрия 183 230 291 330 458 308 544 372 0,175 230 469 210 165 263 224 277 560 329 221 311 702 228 294 258 552 291 396 1,00 439 255 301 412 1,25 437 212 206 362 1,50 250 1,75 124 174 473 5,0 500 610 10,0 Без добавокСреда Во Среда Во1860 445 Сульфат цинка 0,750 Без добавки(контроль) 760 850 865 200 530 Редактор Н.Гунько Техред МХоданич Корректор Г.Реаетник Заказ 1736/28 Тираж 520 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий . 113035Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5