Устройство для измерения электрических параметров биологических мембран

/48 0 05 0 27/О ПС 0 А ИЯ РЕТ ТВУ У ЕТ ТО лец,йауна л иаратор . циалвухуровГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЬГГИЙ(71) Всесоюзный научно-исследовательский институт по охране вод(56) 1. Биофизика мембран. К с,.1971, с. 656-663.2 Авторское свидетельство СССРР 586899, кл. С 12 М 1/34, 1978.3. Гидробиологический журнал Р 4,(54)(57) 1. УСТРОЙСТВО ДЛЯ ИЗМЕРЕНИЯЭЛЕКТРИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕМБРАН, содержащее биоблок, блокуправления, связанный с генераторомимпульсов эталонного тока биоклетоки коммутатором каналов, подключеннымк измерителю, повторители и усилители биопотенциала и регистратор, о тл и ч а ю щ е е с я тем, что, сцелью повышения надежности устройствав работе путем повышения точностиизмерений, оно дополнительно содержит блоки адаптивных аттеньюаторов,электронные ключи, блоки выработкисигнала "Потенциал действия" биоклетки, блок индикации и сигнализации,усилитель биопотенциала снабжен управляеьым элементом регулирования коэффициента передачи сигнала, входкаждого блока выработки сигнала "Потенциал действия" биоклетки связан с выходом повторителя биопотенциала, один из выходов этого блока соединен с блоком индикации и сигнализации, а другой выход - с управляющим входом электронного клича, один из вы.- ходов блока адаптивного аттеньюатора подключен к управляемому элементу регулирования коэффициента. передачи сигнала, другой - к регистратору, а вход этого блока связан с выходом повторителя биопотенциала, электронный ключ управляемым входом подкзпочен к выходу усилителя биопотенциала, а выходом - к регистратору и через коммутатор каналов к измерителю.;, 2, Устройство пои. 1, о т л и- аО ч а ю щ е е с я тем, что блок выработки сигнала тПотенциал действия" биоклетки выполнен в виде комнаратора с резисторами устааки, блока аы- С держки времени, элемента И и выключателя, при этом компаратор входом соединен с выходом повторителя биопотенциала, а выходом - с входом бло ка выдержки времени и одним из входов элемента И, другой вход которого увтз соединен с выходом блока выдержки времени, выход элемента И подключен " ЯО к блоку индикации и сигнализации, а тверез выключатель - к управляющему входу электронного ключа.ж3. Устройство по и. 2, о т 1 вс ч а ю щ е е с я тем, что комп блока выработки сигнала "Потен действия" биоклетки выполнен д невымЪфИзобретение относится к устройствам для исследования химическихсвойств веществ, использующим влияниевоздействия химических веществ наэлектрические параметры биологических мембран, н частности биоклеток 5хароных водорослей, и может быть использовано для контроля (оценки)токсичности природных и сточных вод,сбрасываемых в водные объекты послеиспользования их н оборотном водоснабжении предприятиями пищевой,фарьацентической, химической и др, отраслей промышленности,Известно устройство для измеренияэлектрических параметров биологических мембран,. содержащее ячейку с потенциальными, токонымй и индифферентными электродами, соединенную черезпотенциальный электрод последовательно с повторителем потенциала, дифференциальным усилителем, переключателем режима и токовым электродом, регулятор тока, соединенный через измеритель тока с индифферентным электро,дом, генератор опорных импульсов,соединенный с вторым входом дифференциального усилителя, и генератор импульсон тока, соециненный с переключателем режимов Я .Устройство позволяет измерять потенциалы биологических мембран, величину эталонных импульсов тока, проходящих через биоклетку, и при соответствующей обработке результатов измерений оценить токсичность ноздейстнующих на биоклетку химических веществ, З 5Однако при этом необходимо осуществлять внедрение микроэлектродов н би-.оклетку., Это травмирует биоклетку,снижая процент пригодности биоклетокк эксперименту, требует, помимо определенного навыка у исследователя,дополнительного сложного оборудования, например микроманипулятора имикроскопа, делает процесс подготовкибиоклетки к эксперименту длительным 45а устройство - не пригодным для экспрессного анализа химических веществили оценки токсичности природных источных вод в целях ранней диагностики их загрязнения. 50Недостатком является также отсутствие автоматизации измерений электрических параметров биологическихмембран,Известно устройство для измеренияэлектрических параметров биологических мембран, содержащее ячейку с потенциальным, токовым и индифферентным электродами, соединенную черезпотенциальный электрод последовательно с повторителем потенциала, дифференциальным усилителем, переключателем режима и токовым электродом, регистратор тока, соединенный через измеритель тока с индифферентным электродом, генератор опорных импульсов, 65 соединенный с вторым входом дифферен.циального усилителя, генератор импуяьсов тока, соединенный с переключателем режимов, буферный усилитель, включенный через первый электронный ключ параллельно дифференциальному усилителю, к выходу буферного усилИ- теля подключено запоминающее устройство, а генератор опорных импульсов выполнен н виде генератора серии опорных импульсон, состоящего из пассивного делителя потенциалов и генератора импульсов управления, выход которого соединен через второй электронный ключ с переключателем режимов и .Недостатками этого устройства являются сложность конструкции, необходимость нарушения целостности понерхности биоклетки, их травмирование с целью внедрения в биоклетку микро- электродов, связанная с этим сложность подготовки биоклеток к проведению измерений их электрических па.раметров, Элементы автоматизации, введенные в устройство, не освобождают исследователя от необходимости уделения постоянного ннимания процессу измерений.Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к предлагаемому является устройство для измерения электрических параметров биологических мембран содержащее биоблок, блок управления, связан- ный с генератором импульсов эталонного тока биоклеток и коммутатором каналов, поцключенным к измерителю, повторители и усилители биопотенциала и регистратор 3 . Недостатком этого устройства является возможность участия аномальныхили вышедших из строя в процессе измерения (от воздействия токсикантами) биоклеток н измерительном процессе, что ведет к снижению достоверности получаемых результатов измерений,определенным трудностям при анализеи.обработке неверных результатов измерений, а также снижению достоверности выводов, основанныхна обработке искаженных результатов измерений.При контроле токсичности вод этоприводит к получению ложных выводовоб уровне токсичности вод. В случаеже, если эти выводы являются одним иэкритериев управления работой технологического оборудования водных объектов (задвижек, нентилей и т.д,),выдача ложных аварийных сигналов приведет к нарушению нормальной работыводного объекта,Целью изобретения является повышение надежности работы устройства путем повышения точности измеренияПоставленная цель достигается тем,что устройство для измерения электри1058897 ключен к управляемому элементу 1955 регулирования коэффициента передачи,а другой выход блока 9 подключен крегистратору 8.У каждого из й электронных ключей10 управляемый вход 26 соединен свыходом соответствующего усилителя 5биопотенциала, а выход каждого элект 65 ческих параметров биологическихмембран, содержащее биоблок, блокуправления,.связанный с генератором импульсов эталонного тока биоклетоки коммутатором каналов, подключенным к измерителю, повторители и усилители биопотенциала и регистратор,дополнительно содержит блоки адаптивных аттеньюаторов, электронныеклячи, блоки выработки сигнала "По-етенциал действия" биоклетки, блокиндикации и сигнализации, усилитель биопотенциала снабжен управляемымэлементом регулирования коэффициента передачи сигнала, вход каждогоблока выработки сигнала "Потенциалдействия" биоклетки связан с выходом повторителя биопотенциала, один из. выходов этого блока соединен с блоком индикации и сигнализации, а другой выход - с управляющим входом электрического кляча, один из выходов блока адаптивного аттеньяатора подключен к управляемому элементу регулирования коэффициентапередачи сигнала, другой - к регистратору, а вход этого блока связан с выходом повторителя биопотенциала, электронный кляч управляемым входом подключен к выходу усилителя биопотенциала, а выходом - к регистратору и через коммутатор каналовк измерителю,Блок выработки сигнала "Потенциал действия" биоклетки выполнен в виде компаратора с резисторами уставки, блока выдержки времени, элемента Й и выключателя, причем компаратор входом соединен с выходом повторителя биопотенциала, а виходом -с входом блока выдержки времени иодним из входов элемента И, другойвход которого соединен с выходомблока выдержки времени, выход элемента И подключен к блоку индикациии сигнализации, а через виклячательк управляющему входу электронногокляча. Компаратор блока выработки сигнала "Потенциал действия" биоклетки выполнен двухуровневым.На Фиг. 1 представлена структурная схема предлагаемого устройства; на Фиг. 2 - биоблок, общий вид; на Фиг. 3 - электрическая принципиальная схема блока выработки сигнала "Потенциал действия" биоклетки, на Фиг. 4 - электрическая принципиальная схема блока адаптивного .аттеньюатора и электрическая принципиаль- ная схема усилителя биопотенциала. Устройство для измерения электрических параметров биологических мембран включает биоблок 1, блок 2 управления, генератор 3 импульсов эталонного тока биоклеток 4, усилители5 биопотенциала, коммутатор 6 каналов, измеритель 7, регистратор 8,5 10 15 20 25 ЗО 35 40 45 50 блоки 9 адаптивных аттеньюаторов, электронные ключи 10, блоки 11 вира-, 6 отки сигнала "Потенциал действияф биоклетки, блок 12 индикации и сигнализации.В устройстве имеются й усилителей 5 биопотенциала, М блоков 9 адаптивных аттеньюаторов, й электронных ключей 10 и М блоков 11 выработки сигнала "Потенциал действия" биоклетки.Биоблок 1 имеет также й ячеек 13, каждая из которых снабжена токовыми электродами 14 и потенциальными электродами 15, соединенными через потенциальные элементы 16, переключатели 17 режима работы и повторитель 18 биопотенциала с соответствующим усилителей :5 биопотенциала, одиниз выходов генератора 3 импульсов эталонного тока биоклеток соединен с токовыми электродами 14, а другой выход - с регистратороМ и через коммутатор 6 каналов с измери" телем 7, причем вход генератора 3 импульсов эталонного тока биоклеток соединен с одним из выходов блока 2 управления, другой выход блока 2 управления соединен с коммутатором 6каналов,Каждый из й усилителей 5 биопотенциала снабжен управляемым элементом19 регулирования коэффициента передачи.Каждый из й блоков 11 выработкисигнала Потенциал действия" биоклетки имеет компаратор 20 с резисторами 21 уставки, схему 22 выдержкивремени, схему И 23 и выключатель 24.Вход компаратора 20 присоединен к выходу повторителя 18 биопотенциала,выход компаратора 20 соединен с входом схемы 22 выдержки времени и одним из входов схемы И 23, другой входсхемы И 23 соединен с выходом схемы22 выдержки времени, Выход схемы И23 соединен с блоком 12 индикации исигнализации и через выключатель 24с управляющим входом .25 соответствующего электронного ключа 10,Вход каждого из И блоков 9 адаптивного аттеньюатора соединен с выходомповторителя 18 биопотенциала и входомсоответствующего усилителя 5 биопотен. циала, а один из выходов блока 9 подровного ключа 10 соединенс регистратором 8 и через коммутатор 6 каналов с измерителем 7,В ячейке 13 размещена биоклетка 4, в которой используют клетку харовой водоросли. Камера 27 предназначена для заполнения раствором 10М КС, камера 30 - для заполнения искуственной прудовой водой, камера 29 и 28 ; для пропускания соответственно экспериментального раствора и дистиллированной,воды. Ячейки 13 имеют трубки подвода и слива раствора в каждой камере.Блок 9 адаптивных аттеньюаторов содержит пиковый детектор 31, компараторы.,32 поддиапазонов измерения,схему 33 согласования, дешифратор 34,схему 35 индикации поддиапазонов измерения.Блок выработки сигнала "Потенциал действия" (фиг. 3) содержит двух уровневый компаратор 20 (два операционных усилителя и элемент 36 ИЛИ) с резисторами уставки 21, схему 22 выдержки времени, элемент И 23, выключатель 24, причем 37. - вход компа ратора 20. Выход двухуровневого компаратора соединен с входом схемы выдержки времени и одним из входов схемы И 23, другой входкоторой соединен с выходом схемы 22 выдержки времени, один извыходов 38 блока 11 выработки сигнала "Потенциал действия" биоклетки. Выход схемы И 23 через выключатель 24 соединен с выходом 39 блока 11 выработки сигнала "Потенциал действия" биоклетки и непосредственно с:выходом 38,Вход 40 (см, фиг. 4) является входом блока 9 адаптивного аттеньюатора и пикового детектора 31, выход последнего соединен одновременно с входом каждого из трех компараторов 41-43 соответствующего поддиапазона измерения, Выход каждого компаратора 41-44,поддиапазона измерений через схемы согласования на элементах 4446 И-НЕ связан с дешифратором 34 исхемой 35 индикации поддиапазона измерения на элементах 47-50, 51-54выходы блока 9 адаптивного аттеньюатора,Регулируемый усилитель 55 биопотенциала (см. фиг. 4) содержит усилитель 5 биопотенциала, управляейыйэлемент 19 регулирования коэффициента передачи, включенный в цепь отрицательной обратной связи усилителя,выход 56:, вход 40.Устройство для измерения электрических параметров биологических мембран работает следующим образом.В ячейку (см, фиг, 2) 13 пою.ешант биоклетку 4, в качестве которой берут например, клетку харовой водоросли(.Б 1 Се 11 а Г 1 е%11 з), Харовые водорослипредставляют собой систему побеговс мутовками коротких веточек. Каждое междоузлие состоит из одной гигантской клетки диаметром до 1 мм и длиной 5-10 см и болееКлетки харовых водорослей (благодаря своим значительным размерам, доступности материала, изолированности и четкой дифференцировке основных структур) - удобный объект для проведения исследований. Воэможность выращивания куль-, туры харовых водорослей в лабораторных условиях позволяет проводить эксперименты в течение всего года. Практически в устройстве для получения достоверных данных в процессе измерения участвуют 10 и более биоклеток, которые одновременно подвергаются воздействию ступенчато изменяющихся концентраций токсиканта, В устройстве используются особенности биологической реакции мембран клеток харовых водорослей в частности выявпение сдвигов в электрических характеристиках клеточных мембран в состоянии покоя и при возбуждении.Камеру 27 заполняют 10 М К", камеру 30 - искусственной прудовой водой (КС 104, Нас 10и Сас 104 М), через камеру 29 и 28 пропускают экспериментальный раствор и дистиллированную воду соответственно. Камеры электрически изолирова.друг от друга, например, вазелиновым маслом. Разность электрических потенциалов при покое измеряют с 9 помощью потенциальных электродов 15,находящихся в камерах 27 и 29. Потенциальные электроды 15 изготовлены из полиэтиленовых трубочек, заполненных 2-ным раствором агар-агара на электролите (КС), Импульсы тока пропускают через хлорсеребряные проволоки - токовые электроды 14, расположенные в камерах 29 и 30На воздействие экспериментального раствора биоклетка харовой водоросли реагирует изменением электрофизиологических характеристик, т.е, потенциал покоя клетки изменяется в зависимости от концентрации и количества токсиканта в экспериментальном растворе, изменяется проводимость Измеряемый потенциал биоклетки 4через потенциальные электроды 15 и потенциальные элементы 16 (каломельные полуэлементы), переключатель 17режима работы (несимметричное либо дифференциальное включение), и повторитель 18 биопотенциала поступает параллельно на вход блока 9 адаптивного аттеньюатора и вход усилителя 5 биопотенциала, имеющего управляемый адаптивный аттеньюатором 9 элемент 19 регулирования коэффициента передачи усилителя 5 биопотенциала.Адаптивный аттеньюатор 9 автоматически, в зависимости от величинывходного сигнала, изменяет коэффициент передачи регулируемого усилителя 55 биопотенциала, воздействуя на элемент 19 регулирования коэффициента цередачи усилителя 5 биопотенциала.5Это автоматизирует процесс измерения, исключает необходимость аттеньюирования (исключает любые манипуляции) исследователем входного сиг. нала с целью предохранения перегруз ки последующих каскадов усиления большими уровнями входных сигналов, а также исключает подобные операции при измерении и регистрации снима- .емых с управляемого усилителя 55 15 биопотенциала усиленных входныхсигналов. Входные и выходные сигналы измеряют и регистрируют на постояйном пределе (подднапазоне) измерений, т.е. их приводят к одной, наиболее удобной с точки зрения получения наименьшей погрешности и наибольшей разрешающей способности характера изменения фдрмы регистрируемого сигнала, шкале измерителя 7 и регистратора 8 при любых изменениях входного сигнала.При этом поправочный коэффициент, необходимый для определения абсолютного (истинного) значения измеряемого параметра, индицируется схеюой 35 индикации поддиапазона измерений соответствующего адаптивного аттеньюатора 9, а также вводится е регистратор 8 в виде определенной маркерной отметки. 35В случае, когда функции регистратора 8 совмещает в себе ЭВМ, поправочные коэффициенты по каждому из каналов определяются путем опроса состояния схем 33 согласования,от ражающих состояния компараторов 32 поддиапазонов измерения., Адаптивный аттеньюатор 9 состоит иэ пикового детектора (экстрематор) 31, включенного на выход повторителя 45 18 биопотенциала и вход регулируемого усилителя 55 биопотенциала, трех схем компараторов 32 поддиапазона измерения (т.е. всего четыре поддиапаэона измерения), схемы 33 согласова ния, дешифратора 34, схемы 35 инди,кации поддиапаэона измерения.В зависимости от величины входного сигнала срабатывают те иэ трех компараторов, для которых входной сигнал превышает уровень компарирования. Например, если сработал первый, то общее состояние: первый - ф 1", второй - "0" и третий - фО", т.е.001 и т.д, На выходе компаратором 41-43 формируется двоичный код, кото 60 рый через схемы 44-46 согласования поступает на входы дешифратора 34 и схему индикации поддиапаэона на элементах. 47-50, а через выходы 51 .54 и интерфейс в ЭВМ (регистратор 8)65 Эти выходы опрашиваются ЭВМ каждыйцикл измерения и указывают коэффициент усиления, В зависимости от входного кода дешифратора срабатываютте или инйе ключи, осуществляющиесоответствующее переключение резисторов, составляющих управляемый элемент 19 регулирования коэффициентапередачи усилителя 5 биопотенциала,включенных в цепь отрицательной обратной связи иусилителя 5 биопотенциала,С выхода 5 б управляемого усилителя 55 биопотенциала усиленный измеряемый сигнал поступает черезэлектронный ключ 10 на регистратор8 и через коммутатор б каналов (выбор канала осуществляют вручную илиавтоматически с блока управления 2)на измеритель 7,Когда биоклетка 4 гибнет от воздействия большой дозы токсиканта,либо по иным причинам, потенциал по- .коя ее резко снижается. Время развития этого процесса (" Потенциал действия") составляет 3-5 с. В этомслучае компаратор 20 блока 11 выработки сигнала Потенциал действия"биоклеткн срабатывает и прекращаетпоступление искаженной информациик измерителю 7 и регистратору 8. Этоповышает достоверность получаемыхрезультатов измерения, а следовательно, и выводов, сделанных на основеих последующей обработки; Компаратор 20 имеет регулировку уровнякомпарируемого сигнала с помощьюрезисторов уставки 21 (путем пере-.пайки резисторов). Для исключе(ияложных срабатываний блок 11 выработки сигнала "Потенциал действия" биоклетки 4 прекращает доступ инфор"мации к измерителю 7 и регистратору8 через определенный промежуток времени после срабатывания компаратора20, обусловленный схемой выдержкивремени 22, выдержка времени которойобусловливается развитием явления"Потенциал действия" биоклетки исоставляет, как указано выше, 3-5 с.При этом электронный ключ 10, ко- ,торый в нормальном состоянии полностью открыт, закрывается тольков том случае; когда на входах схеьаюИ 23 присутствуют оба сигналас выхода компаратора 20 и схемы выдержки времени 22, а .контакт выключателя 24 замкнут.Выключатель 24 необходим для исследовательских целей, например, длязаписи и измерения электрических параметров биоклеток при явлении "Потенциала действия", интерполяриэациибиоклеток и в тех случаях, когдабиоклетка ведет себя таким образом,что блок 11 выработки сигнала "Потенциал действия" срабатывает, блокируя измеритель 7 и регистратор 8.При срабатывании блока,11 выработки сигнала "Потенциал действия" биоклетки сигнал управления с выхода схемы И 23 поступает в блок 12 индикации и сигнализации, который осуществляет индикацию канала с аномаль ной биоклеткой, а также сигнализацию, например.звуковую, для оповещения исследователя р необходимости замены аномальной биоклетки нормальной, иэ числа резервных, Поскольку у некото рых биоклеток при воздействии токсиканта потенциал покоя резко увеличивается (эффект гиперполяризации),комйаратор 20 выполнен двухуровневым,35Генератор эталонных импульсов тока биоклеток 3 служит для формирования раэнополярных эталонныхимпульсов тока с программированием блоком 2 управления величины, длительности и паузы между импульсами (длительность их определяется временем рефракторности мембран и лежит в пределах 2-10 с),Подаваемые от генератора эталонные импульсы тока выполняют функцию стимулятора биоклетки, поддерживая ее чувствительность (раздражимость) на постоянном уровне, служат для определения электрического сопротивления (либо проводимости) мембраны биоклетки, необходимого для осуществления оценки влияния химических веществ на потенциал биоклеток, а также оценки (в завйсимости от характера их воздействия) токсичности природных или сточных вод.Предлагаемое устройство по сравнению с известными позволяет значительно ускорить процесс измерения электрических параметров биологических мембран биоклеток путем автоматизации самого процесса измерения и регистрации результатов измерений и может быть применено для различных экспрессных методов анализа химических веществ и оценки токсичности природных и сточных. вод на ранних стадиях их заражения.