Способ получения личинок геогельминтов

,8)содержзитичесусловиягии", 1 ание и ких нема х. "Успе 958, 46,3Геличинок оды ис-.53, т.1,Гагариния яицрные меарии,б Ю у УМсл ф ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИ ОПИСАНИЕ ИЗН АВТОРСКОМУ СВИСТЕЛ(71) Институт зоологиской ССР(56)1 е Кротов А, и.культивирование паратод в искусственныххи современной биолоМ 2, с. 230-239,(54) (57) спосов получкния личинок ГЕО-ГЕЛЬИИНТОВ, включаюший выделение из самок нематод яиц, культивирование яиц на питательной среде и отделение выцедших личинок, о т л ич а ю щ и.й с я тем, что, с целью повышения выхода личинок, перед выделением яиц самок нематод помещают в 3-5 ный раствор. 9 -дизтиламино.изобутиронитрила на 2-4 ч.Изобретение относится к ветеринарной,гельминтологии, в частностик культивированию личинок нематодв лабораторных условиях при изученииэкологии экзогенных стадий развитиянематод, влияния физических Факторовсреды и разработки новых методовпрофилактики нематодов сельскохозяйственных животных.Известен способ получения личинокгео-гельминтов в лаборатории, который осуществляется следующим образомяйца, полученные из фекалий методами,.Флотации или осаждения, или яйца, полученные из гонад самок путем потрошения,.помещают в оптимальные для развития . 15условия, используя в качестве средыводу, воду с фекалиями, .опилки и др,Через определенное время (в зависимости от условий культивирования)выходят личинки, которых надо различ ными способами собрать, очистить отчастиц среды и микрофлоры антибиотиками, перед посевом на новую чистуюсреду для дальнейшего культивирования провести подсчет, отобрать необходимое кх количество 11.Недостатками способа являютсятрудоемкость и низкий выход личинок.Известен также способ полученияличинок гео-гельминтов, включающийвыделение из самок нематод яиц, куль- З 0тивирование яиц на питательной среде и отделение вышедших личинок ( 2),Недостатком данного способа является малый выход личинок, так какпри промывании их антибиотиками и 35водой и переносе в другую среду частьличинок теряется в период культивирования,Цель изобретения - повыаение выхода личинок гео-гельминтов.40Поставленная цель достигаетсятем, что перед выделением яиц самокнематод помещают в 3-5-ный раствор-диэтиламиноизобутиронитрила на 452-4 ч.-Диэтиламиноизобутиронитрил оказывает стимулирующее действие ыа яйца в гонадах живых самок. Через 1-1,5 сут после гибели самок в воде при 19-23 С в тело ее выходят активные личинки. Они питаются внутренними органами, продвигаясь к вульварному или ротовому отверстиям, через которые могут выходить во внешнюю 55 среду, Кроме того, при переносе самок из раствора в воду на них остаются частицы р -диэтиламиноиэобутиронитрила, который ингибирует развитие микрофлоры в среде культивирова" 60 ния.,ь-Диэтиламиноизобутиронитрилотносится к химическому соединению,в частности к Р -М-(диалкил) эамещенным йасыщенным алифатическим аминонитрилам изостроения, и имеет ФормулуСНз - бНрю- н; к-мгСн, - Н СН,ГСтруктура -диэтиламиноизобутиронитрила подтверждается результатами ИК-спектроскопического анализа. В спектре соединения отмечаются полосы (см ) диэтиламинной.группы: Нз- бНгбНз - бН 2780, 949, 1010, 1080, 1140, 2825,2880, 2940, 2980, 3200, 3450 иизобутиронитрильной группы:бНг 1-Н СМбн830, 940, 1280, 1380, 2250, 2825,2880, 2940, 2980, Подчеркнутые полосы имеют нахождение полос второгоФрагмента,Все эти полосы, имеющиеся вприлагаемом ИК-спектре, подтверждаютструктуру Ъ-диэтиламиноизобутиронитрила, который образуется в результате присоединения диаэтиламина кметакрилонитрилу (см. чертеж).Съемка проб производится на ИКспектрофотометре ИК("К Цейсс"Иена). Прозрачный жидкий образец снимается без растворителя в герметич"ных стандартных кюветах из КВ г столщиной 40-54 мкм,Испытание соединения в качествестимулятора развития яиц и выходаличинок геогельминтов и ингибиторамикрофлоры в лабораторных условияхпроводят в чашках Петри на гельмин-.тах из родов Тг 1 сЬойгоорбоз, йввюЮод 1 н 6, ИагзЬОИор 1 а и видов Нось 1 оисЬ 3 соиФ,Ооб и 058 у 1 ог 1 ОС 1 Сов сесеГельминтологический материал собирают иэ кишечного тракта овец и хранят до начала опытов (3-4 ч) при28-32 С в термосе о физраствором.Растворы-диэтиламиноизобутиронитрила готовят в дистиллированнойводе в объемных процентах.Всего поставлено 15 опытов в трехповторностях, пяти вариантах. В каждую чашу Петри вносят по 10-20 самокодного из названных видов нематод,в гонадах которых имеются зрелыеяйца. По окончании экспозиции 70самок, не отвытцх от раствора, переносят в водопроводную дехлорированную Воду. Контролем служат самкитех же видов, не обработанные раствором ) -диэтнламин эи зобутнронитрнла., . содержащиеся в тех же условиях.Температурные условия опытов"23 С.Наблюдения за поведением и развитием обаектов. проводят с помощью бинокулярной лупы ИБСи мнкроско па ИВР. дважды в сутки.В периодмассового выхода личинок в. теле самок обнаружено 16-25, живых активных личинок. . 0П р н м.е р 1. Стимулирование развития яиц и личинок в самках Насвопс 1 еб салФотЫз. Живых самок гемойхов помещают и чащкн Петри с водным раствором )-дизтнлаьаноизобуткро 45 нитрила 3 и 5-ной концентраций аа 1, 4 и 21 ч. По окончании экспозиции. самок, .еще живых, переносят (не отмывая) в 60. мя водопроводной воды (70 самок). Через 24:ч самки гибнУт, щ а.через 48 ч посленачала опыта из яиц внутри тела самки начинают.ж-ходить личинки. ( стадии,. активно двн гаясь в передний отдел тела. Наиболее . массовый выход их иаблкдается нри экспозиции в растворе 4 ч и 5%-иой конФентрацин раствора в дехлорирован": ной воде при 19-23 фС. Начало выходаличинок - конец первых суток послегибели самки.Стимулирование развития яиц прнпомощи Р -днзтнламиноиэобутиронитрилапроисходит только в гонадах живыхсамок (табл. 1, пункт 1).П р и и е р 2. Действие раствора -дизтиламиноизобутироннтрила на . самок н яйца в них:нз рода Ъ"сйоВ Ьоп(рРцэ . Иэ табл. 1 (пункт 2) видно,. что стимулирующее,действие раствор. оказывает также на аивых самок нематод.Живых .самок трихостронгнлнд помещают в 2 и 5%-ные раствсры биологически активного вещества на б сут,. 3 и 4 ч, затем, не отвнаая,.в водопроводную декорированную воду (табл. 1.). Наблюдения показали, .что длитедъная экспозиция савюк в растворе препятствует дальнейшему развитию яиц - они гибнут. Наиболее эффективны условия экспозиция самок в растворе 4 ч при концентрации в объеме 5 В и 19-23 фС.: Через 1-1,5 сут после гибели самки в полость ее тела. выходят личинки..1 Х 1 1 +РХФ 81 Ю+Ь.О яь ХьмаХ Хь Юь,оххЛПЮь Вханц хоьО Ц 1 Хь Хьььйь Хь 3 1 +ОЦ 1 Еьч.ьФФ 311 ЫО О1Нк х о кх 5 ХЬ ХьФХФ 1 Ф 31 3 Н 34 1 а РяььйОеФОь.жаоав, Фа йЮ Ф хна 1 о м;д й И Ф р оПрн уменьшении экспозиции до 3 чвремя начала выхода личинок увеличивается до 4 сут,П р и м е р 3. Самок ОэМгЬзраСгеощСвсФ,О, активных и ослабленных, выдерживают в 5-ном раствореЬ-диэтиламиноизобутиронитрила в течение 3 и 4 ч, Активные самки болеевосприимчивы к действию этого раствора: они быстрее гибнут и и нх половом аппарате развитие яиц ускоряется - личинки выходят уже через сутки, тогда как в ослабленных.самкахг.ыход личинок наблюдается лишь спустя 2 сут после их гибели. Табл. 1(пункт 3) иллюстрирует этот выводи показывает, что трехчасовое действие 5-ного раствора-диэтиламиноизобутнронитрила наиболее эффективно, личинок в этом случае формируетсянаибольшее количество. Длительноедействие раствора меньшей концентрацйи неэффективно.Лучшими условиями для выхода личинок остертагий в теле самок при19-23 аС можно считать: концентрациюр -диэтиламиноизобутиронитрила 5,экспозицию самок в растворе 3 ч,среду культивирования - дехлорированную воду. Выход личинок наблкда.ется через 1-1,5 сут после гибелисамок.П р и м е р 4. В тех же условияхизучается действие растворов-ди.этиламиноизобутнронитрила на самокнематод из рода МозЬаИоца и Йева -Юод 1 го 6 . Взрослые паразиты последействия раствора гибнут в те же сроки, что и описанные виды. В теле погибшей самки в течение первых трехсут идет развитие яиц, но затем онопрекращается и яйца гибнут. ДЛя этихвидов гельминтов свойственно длительное развитие яиц и личинок в них -1 или 2 линьки протекают в яйце. Личинки в теле самки для этих видовнематод не получены.Стимуляция развития.яиц и выхода1 О личинок внутри тела самок-диэтиламиноизобутиронитрилом возможна длянематод стронгилоидного типа развития.П р и м е р 5. Во всех опытах при5 наблюдении за. развитием яиц в телесамки нематод учитывается такжестепень развития микрофлоры по сравнению с контрольными вариантами (самки нематод, содержащиеся в чашкахс дехлорированной водопроводной водой,не подвергающиеся действию р -диэтиламиноизобутиронитрила).Многократные наблюдения показывают, что 7-15 самок, не отмытых от5 5-ного раствора р -диэтиламиноизобутироннтрила, перенесенные в 60-8 Ь млводы, содержат достаточное количествовещества, способного подавить ростмикрофлоры в среде культивирования.В течение первых трех суток рост микрофлоры иигибируется полностью, в последующие 4-б сут развивается единичное число микроорганизмов и толькоспустя 7-8 сут в среде культивирования.появляется незначительное их ко 35 личество, не мешающее развитию личинок (табл. 2),Заказ 3749/5 Тираж 721ВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, 3-35, Раушская наб д. 4/5 Подписное филиал ППП "Патентф, г. Ужгород, ул, Проектная, 4 В связи с этим проводят испытанияразличных концентраций (от 0,01 до5,0) В -диэтиламинонзобутиронитрилакак ингибитора микро 4 доры. Результаты испытаний, представленные в табл.2,"подтверждают проведенные наблюдения.5-Диэтиламиноиэобутиронитрил, стимулируя развитие яиц в самках нематод,одновременно ингибирует в среде культивирования развитие микрофлоры.Применение преднагаемого способа 10обеспечивает ряд преимуществ в сравнении с известным,Во-первых, так как яйца развиваютсй в полости тела самки, исключаетсяпроцесс потрошения и их сбор, отнимающий, как правило, большую часть времени при постановке опытов (2-3 рабочих дня. Кроме того, отпадает необходимость работы с микроскопическимиобъектамо, во-вторых, после гибелисамок под действием (3 -диэтиламяноичобутиронитрила в гонадах развиваются все зрелые яйца, исключена возможность их механического повреждения, обеспечен учет дефектных и незрелых яиц;в-третьих, нет необходимости очищать среду от остатков тел нематод,которые, как правило, служат пищейгнилостйой микрофлоре, кроме того,на этом этапе экономится время,в-четвертых, исключается процессоткрывания личийок и очистка среды отизбытка микрофлоры, так как.даже вочень незначительных дозах в -диэтиламиноизобутиронитрнл сам ингибнруетрост микроорганизмов, а значит, отпадает потребность в антибиотиках иэкономится время,в-пятых, так как личинки сконцентрированы в теле нематоды, исключаетсяучет личинок неизвестного вида, чтоважно для диагностики личинок на разных стадиях развития этот способ дает воэможность при вырацивании личинок проводить диагностику самок (видовую)