Способ совместного культивирования кишечных иерсиний и грибов рода candida

-ТД,чягкс р ПИСАН ТЕНИ институ апсеу В,У. )птезт)па атпо)09)а УЛЬТИВ НИЙ И ГР я микробиспособ со- кишечных ицинск етения ования ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОВЕДОМСТВО СССР(54) СПОСОБ СОВМЕСТНОГОРОВАНИЯ КИШЕЧНЫХИЕРСИБОВ РОДА САМО)ОА(57) Использование: медология. Сущность изобрвместного культивир Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии,Цель изобретения - создание более благоприятных условий для совместного культивирования грибов рода Кандида и кишечных иерсиний, расширение сроков наблюдения за взаимным влиянием грибов и иерсиний при их совместном культивировании, упрощение и удешевление способа изучения взаимного влияния на питательной среде с использованием компонентов отечественного производства.Цель достигается тем, что способ совместного культивирования кишечных иерсиний и грибов рода Кандида осуществляется путем посева равных обьемов смыва суточной культуры грибов с кандида-агара буфер. ным физиологическим раствором, содержащего 10 -10 кл/мл, и бульонной7 Всуточной культуры кишечных иерсиний, со 1822873 А иерсиний и грибов рода Сапб)ба заключается в посеве чистых культур иерсиний и грибов рода Сапб)ба на жидкую питательную среду, содержащую, гlл; пептон 10.0-13,0 сорбит 10,0 - 13,0, хлорид натрия 8,0 - 9,0; фосфорнокислый калий двузамещенный 5,0-6,0, а -метионин 0,5 - 0,6, тиамина бромид 0,1 - 0,2, дистиллированная вода до 1 л, рН 7,5-7,8. инкубирование проводят при температуре 22 - 28 или 35-37 С в течение 14 сут с добавлением питательной среды того же состава на 3 и 5 сут и затем пересевают на дифференциально-диагностические среды. 4 табл., 2 ил. держащей 10 -10 кл/мл, на питательный бульон, содержащий пептон, сорбит, хлористый натрий, двузамещенный фосфат калия,-метионин, тиамина бромид, дистиллированную воду; инкубированием при температурах 35-37 С и/или 22 - 28 С в течение 14 суток с добавлением той же среды на 3 и 5 сутки, с последующим высевом по 0.1 мл из смешанной культуры на кандида-агар и агаризованную среду Кода для получения чистых культур кишечных иерсиний и грибов, подвергшихся влиянию при совместном культивировании, Для приготовления плотной среды кандида-агара необходимо 48 г порошка высыпать в колбу с 1 л дистиллированной воды, прокипятить в течение 1-3 мин на слабом огне, профильтровать через марлевый фильтр, повторно довести до кипения, охладить до 55 - 60 С, разлить в стерильные чашки Петри и подсушить втермостате при 36,5-37,5 ОС в течение 40 - 45 минут.Для приготовления питательного бульона используют гидролиэат рыбный концентрированный, хлорид натрия, дистиллированную воду при следующем соотношении компонентов, г/л:Гидролизат кильки 33,0-35,0 Хлорид натрия 7.0-8.0 Дистиллированная вода до 1 литра рН раствора доводят до 7,2-7,4 Для приготовления буферного физиологического раствора используют однозамещенный и двуэамещенный фосфаты натрия, хлорид натрия и дистиллированную воду при следующем соотношении компонентов, г/л:Однозамещенный фосфатнатрия 0,1-0,3 Двузамещенный фосфатнатрия 1,5-1,7 Хлорид натрия 8,0-8,4 Дистиллированная вод до 1 литра рН раствора доводят до 7,1-7,3 Краску для заполнения камеры Горяева готовят следующим образом, К 100 мл 3- ной уксусной кислоте добавляют 0,04 - 0,06 г генцианвиолета, взбалтывают. выдерживают в термостате при 36,5 - 37,5 С в течение суток, фильтрукю через бумажный фильтр. Суточную чистую культуру грибов, выращенную на кандида-агаре, смывают 2-3 мл буферного физиологического раствора, Подсчет клеток осуществляют в камере Горяева по общепринятой методике и доводятв концентрацию клеток грибов до 10 -10 кл/мл. Суточную чистую культуру кишечных иерсиний, выращенную на питательном бульоне, центрифугируют при 2000 - 2200 9, взвешивают в 2-3 мл буферного физиологического раствора. Подсчет клеток осуществляют в камере Горяева по общепринятой методике и доводят концентрацию клеток кишечных иерсиний до 10 - 10 кл/мл. Для приготовления питательного бульона с сорбитом используют пептон, сорбит, хлорид натрия, двузамещенный фосфат калия, 1: метионин, тиамина бромид и дистиллированную воду при следующем соотношении компонентов, г/л:Пептон 10,9-13,0 Сорбит 10,0-13,0 Хлорид натрия 8,0-9,0 Двузамещенный фосфаткалия 5.0-6,0-метионин 0,5-0,6 Тиамина бромид 0,1-0,2 Дистиллированная вода до 1 литра рН раствора доводят до 7,5-7,8 Для полного растворения пептона, сорбита, хлорида натрия, двузамещенного фосфата калия их вносят в дистиллированную воду, кипятят 1 - 2 минуты, охлаждают до 50- 5 60 С, вносят 1.-метионин и тиамина бромидразмешивают до полного их растворения, фильтруют через бумажный фильтр, разли вают в пробирки по 3-4 мл, стерилизуют вавтоклаве (стерилизаторе) при 0,5 атмосфе ре, 120 С, 20 мин. В случае необходимостиможно разлить питательный бульон до стерилизации во флаконы емкостью 0,5 литра по 0,2 - 0,25 л. Раствор можно хранить в холодильнике при+4+6 С в течение 20 - 30 дн.15 Микротитратором вносят в пробирку по,025мл суспензии клеток грибов и кишечных иерсиний, содержащую 3-4 мл питательного бульона с сорбитом. Инкубирование осуществляют в термостате при температурах 20 22 - 28 С и/или 35,0-37 С в течение 14 сут сдобавлением той же среды на 3 и 5 сутки в количестве 1 - 2 мл. Для приготовления агаризованной среды Кода необходимо 43 г порошка размешать в 1 литре дистиллированной воды, добавить 9,0 - 10,0 грамма агар-агара, прокипятить в течение 1 - 2 мин, профильтровать через марлевый фильтр, повторно довести до кипения, охладить до 55,0 - 60 С, разлить в стерильные чашки Пет ри и подсушить в термостате при 36,537,5 ОС в течение 40-50 мин. Из смешанной культуры в питательном бульоне с сорбитом высевают по 0,1 мл на агаризованную среду Кода и кандида-агар для получения чистых 35 культур кишечных иерсиний и грибов родаКандида, подвергшихся взаимному влиянию при совместном культивировании.Изобретение поясняется следующимипримерами.40 П р и м е р, Суточные культуры грибов;рода Кандида, выделенные от детей с кишечными дисфункциями и от взрослых больных кишечными острыми заболеваниями, смывают буферным физиологическим рас твором с кандида-агара, суспендируют, подсчитывают количество грибных клеток в камере Горяева по общепринятой методике.Суточные бульонные культуры И.энтероколитика, серовары 03 и 09, плаэмидные и 50 бесплазмидные варианты (налачие плаэмиды вирулентности определяли по комплексу культурально-морфологических признаков: способности к аутоаглютинации, кальцийзависимости роста, размеру колоний при 26 С 55 и 37 С), выделенные от больных иерсиниозом. а также музейные штаммы, центрифугируют, суспендируют в буферном физиологическом растворе, подсчитывают количество клеток кишечных иерсиний в камере Горяева по общепринятой методике.Микротитратором вносят в питательный бульон с сорбитом суточные культуры грибов рода Кандида и кишечных иерсиний, Инкубируют в течение 14 суток при температуре 22-28 С в термостате с добавлением той же среды на 3 и 5 сутки для восполнения питательных компонентов. Через 3,5, 7,9 и 14 сут из смешанной культуры грибов рода Кандида и кишечных иерсиний высевают по 0,1 мл на агаризованную среду Кода и кандида-агар для выделения чистых культур микроорганизмов. По аналогии с вышеуказанным примером проводят инкубирование тех же штаммов микроорганизмов, но при температуре термостата 35 - 37 С. Высевы на 3, 5, 7, 9 и 14 сутки совместного культивирования грибов и иерсиний. В дальнейшем у выделенных культур грибов рода Кандида изучают один из главных факторов патогенности - способность к адгеэии. Адгезионная активность изучалась по способности прикрепления грибных клеток и эпителиоцитам слизистой оболочки ротовой полости по методике, разработанной на кафедре микробиологии Рязанского медицинского института им,академика И.П.Павлова Р. Н, Ребровой, И, Н.Денисовым и др, (авторское свидетельство ЛВ 1517943, бюл. %40, 1989).Докультивирования с кишечными иерсиниями индекс адгезии, выделенных от детей грибов рода Кандида, составил 6,61 ч.1,51 и от взрослых - 8,81+0,98. Статистического различия индекса адгезии в этих возрастных группах не выявлено. После совместного культивирования индекс адгезии составил для штаммов, выделенных от детей 10,44+1,96 и для штаммов, выделенных от взрослых, 23,48+1,88, что позволяет установить увеличение этого показателя соответственно в 1,58 (р0,05) и 2,72 раза (р0,01), Статистическая обработка результатов исследований по возрастным группам показали, что адгезионная активность грибов рода Кандида, выделенных от взрослых после совместного культивирования с кишечными иерсиниями была больше в 2,24 раза, чем у штаммов грибов, выделенных от детей (р0,01). В табл. 1 и 2 представлены результаты количественного исследования по обнаружению кишечных иерсиний (кл/мл), выделенных из смешанных культур после совместного культивирования с грибами рода Кандида по известной и предложенной методикам при 26 С и 37 С в термостате в течение 3, 5, 7, 9 и 14 дн. Из таблиц видно. что по известной методике после культивирования при 26 С происходит снижение количества клеток кишечных 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 иерсиний в контрольной группе и отсутствие роста после совместного культивирования с грибными клетками после 3-х сут.По предложенной методике в аналогичнйх условиях культивирования (26 С) рост кишечных иерсиний наблюдается как в чистой культуре, так и в сочетании с грибами рода Кандидапричем происходит увеличение количества клеток иерсиний на 3 сутки, с последующим постепенным снижением к 9 дню и наличием вторичного роста на 9-14 сутки культивирования в контрольных и опытных группах (в 35.71 случаях культивирования на питательном бульоне с сорбитом не выявлено вторичного роста кишечных иерсини После культивирования при 37 С при использовании известной методики обнаружен рост клеток иерсиний в контрольной и опытной группах лишь на 3 сутки, причем количество кл/мл в опытных группах значительно меньше, чем в контрольных, На 3, 5, 7 и 9, 14 сутки рост отсутствует во всех группах, По предложенной методике наблюдается рост кишечных иерсиний не только в течение 3 суток, но и на протяжении 2-х недельного срока исследо-, ваний (вторичный рост не выявлен в 42,86). На основании изложенного можно считать, что предложенная методика имеет ряд преимуществ по сравнению с известной методикой:- сохраняет большее число жизнеспособных клеток кишечных иерсиний в смешанных культурах с грибными клетками.- позволяет увеличить сроки наблюдения за взаимным влиянием кишечных иерсиний и карибов рода Кандида с 3 суток до 14,- расширяет температурный диапазон наблюдений за совместным культивированием грибов и иерсиний, так как позволяет проводить исследования как при 26 С, так и при 37"С, что приближает предлагаемый способ к условиям жизни микроорганизмов в организме человека,В табл. 2 и 3 представлены результаты количественного исследования по обнаружению грибных клеток, выделенных после совместного культивирования в течение 3, 5,7,9 и 14 сут по известной и предложенной методикам. После культивирования при 26 С по известной методике в контрольной группе происходит увеличение количества кл/мл к 5 суткам с последующим снижением числа грибных клеток к 14 дню. В опытных группах наблюдается неуклонное нарастание к 14 дню. По предложенной методике в аналогичных условиях культивирования в контрольной группе происходит увеличение кл/мл к 9 дню с последующим снеж.пнем к 14 суткам, В смешанных культурах также5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 наблюдается более постепенное, но неуклонное увеличение грибных клеток к 14 дню. После культивирования при 37 С по известной методике происходит увеличение грибных клеток к 7 дню в контрольной группе с последующей стабилизацией процесса роста к 14 суткам, В опытных группах отмечено неуклонное увеличение к 14 дню, По предложенной методике в аналогичных условиях культивирования происходит увеличение числа грибных клеток к 5 дню с последующим снижением к 14 суткам в контрольной и опытных группах, Сопоставление культивирования грибов рода Кандида в присутствии кишечных иерсиний по предложенной и известной методикам показало неуклонное нарастание числа грибных клеток в течение всего срока при И С и 37 С, Предлагаемая методика позволяет обнаружить грибные клетки в течение всего срока наблюдения Угнетение роста кишечных иерсиний прииспользовании среды по известной методике можно объяснить изменением рН самойсреды (рис,1, 2). На рисунках изображены кривые изменения рН среды при совместном культивировании кишечных иерсиний и грибов рода Кандида по известной и предложенной методикам в условиях инкубирования в термостате при 26 и 37 С. рН питательной среды после совместного культивирования по известной методике значительно снижается на 3 сутки в кислую сторону с последующей стабилизацией рН и переходом в нейтральную, рН питательного бульона с сорбитом при использовании предложенной методики после совместного культивирования лишь незначительно снижается доходя до нейтральных значений на 3 суки с последующей стабилизацией рН среды к 7 суткам. Следовательно, торможение размножения кишечных иерсиний и их отсутствие после 3-х суток можно объяснить снижением рН питательной среды в кислую сторону.Таким образом, предложенный способ совместного культивирования кишечных иерсиний и грибов рода Кандида на питательном бульоне с сорбитом имеет следующие существенные преимущества:1. Создает более благоприятные условия для совместного культивирования кишечных иерсиний, и грибов рода Кандида,сохраняет большее число жизнеспособныхклеток кишечных иерсиний,2. Позволяет увеличить сроки наблюдения эа взаимным влиянием кишечных иерсиний и грибов рода Кандида при ихсовместном культивировании с 3 до 14 суток,3, Расширяет температурный диапазоннаблюдений, так как позволяет изучатьсвойства и кишечных иерсиний, и грибоврода Кандида после совместного культивирования как при 26 С, так и при 37 С.4, Предложенный способ позволяет стабилизировать рН питательного бульона ссорбитом, что оптимизирует рост кишечныхиерсиний и грибов рода Кандида в смешанных культурах.5. Упрощает и удешевляет способ изучения взаимного влияния на питательной среде с использованием компонентовотечественного производства. Ориентиро- .вочная стоимость 1 литра питательногобульона с сорбитом составляет 0,3 - 0,5 руб,1 литра достаточно для проведения 40-60серий опытов,Формула изобретенияСпособ совместного культивированиякишечных иерсиний и грибов рода Сапбда,включающий посев исследуемых культур нажидкую питательную среду с последующиминкубированием посевов, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью упрощения способа,посев чистых культур иерсиний и грибов рода СапО ба проводят в жидкую среду, содержащую, г/л:пептон 10,0-13,0Сор бит 10,0 - 13,0Хлорид натрия 8.0-9,0Фосфорнокислый калийдвуэамещенный 5,0 - 6,0а -Метионин 0,5-0,6Тиамина бромид 0,1 - 0,2дистиллированная вода до 1 л,рН 7.5 - 7,8,инкубирование проводят при температуре22 - 28 С или 35-37 С в течение 14 сут сдобавлением питательной среды того жесостава на третьи и пятые сутки и затемпересевают на дифференциально-диагностические среды.1 О 1822873 Таблица 1 Количественные исследования по обнаружению кишечных иерсиний в смешанных культурах с грибами родэ Кандида, проведенные параллельно по известной и предложенной методикам в динамике при 22-28 С (кл/мл 109) ца Таблица Количественные исследования по обнаружению грибов рода Кандида в смешенных кул рах с кишечными иерсиниями, проведенные параллельно по иэвестной и предложенно методикам в динамике при 26 С (кл/мл 10 ) ту Количественные исследования п ах с грибами родэ Кандида, про тодикамбнаружению кишечных иерсиний в смешенные параллельно по известной и предлинамике при 37 С (кл/мл 109) ых культуенной ме1822873 12Таблица 4 Количественные исследования по обнаружению грибов рода Кандида в смешанных культурах с кишечными иерсиниями, проведенные параллельно пб известной и предложенноаметодикам в динамике при 27 фС (кл/мл 10 ) агриба родо Ищдц 0 аюцаечиве иерсцицц. --- ношенные церсинии грийи родо Кандидацг.гробы рс 3 а Юцеий аюиекегг церсцноо---- ю шечные иерсиниц 7 робы РОЮ Моидцд 0Составитель А, СтариковТехред М.Моргентал Корректор И. Шулла Редактор Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 Заказ 2173 Тирэж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5