Способ определения концентраций хлорофиллов а, в, с и их феофитинов

Способ возможно использовать нетолько для анализа проб морских водвдали от берега, но и для проб водлюбых естественных водоемов,Определение концентрации хлорофилов а, Ь, с и их феофитинов включаетприготовление экстракта пигментовв 907-ном водном ацетоне, измерениеинтенсивности флуоресценции экстракта в красной части спектра, возбуждаемой в синей части спектра, повторное измерение интенсивности флуоресценции после подкисления экстрактасоляной кислотой и определение концентрации пигментов по измеренныминтенсивностям флуоресценции. Интенсивность флуоресценции исследуемогораствора измеряют трижды до его подкислення при трех различных условиях 20возбуждения и регистрации и триждыпосле подкисления при тех же трехразличных условиях возбуждения и регистрации, причем один раз при измерении преимуцественно пары хлорофилл 25а (хл а) - феофитин, а (фео а) длина волны максимума возбуждения устанавливается в диапазоне 430-440 нм,а соответствующая ей длина волны максимума регистрации интенсивности 30флуоресценции в диапазоне 670-676 нмвторой раз при измерении нреимущественно kары хлорофилл в (хл.в) - феофитин в (фео в) соответственно вдиапазонах 460-465 нм и 653-659 нм;третий раз при измерении преимущественно пары хлорофилл с - феофитин ссоответственно в диапазонах 444-448 нми 636-640 нм,Указанные условия измерения выби" 40раются на основе следующих экспериментально установленных данных: 1. Длины волн максимумов поглощения в синей части спектра (Л,) и 45 максимумов флуоресценции в красной части спектра (Я) для измерения пигментов в 902-ном водном ацетоне различны (см.табл,1).2. Кислотные факторы К, для хлорофиллов а,Ь,с, т.е, отношения регистрируемой интенсивности флуоресценцин раствора до его подкисления (Р ) к регистрируемой интенсивности флуоресценции раствора после подкисления (Р) при неизменных остальных условиях измерения также различны и зависят от условий измеренийвязь , дел . воешь . рек(от Л макс".маис е дЛ о в д" 0,5 )При выборе условий измерений исходили из следующих соображений.Длины волн максимумов возбуждеВфэЬ рег ния 3и регистрации Л макс выбираются из условия максимального различения хлорофилла от соответствующего феофитина с учетом известного кислотного фактора " с одной стороны и получения максимального сигнала от хлорофиллов.а не от их феофитинов с другой. Это означает, что нри прочих равных условиях предельно обнаруживаемые концентрации для феофитинов будут несколько выше, чем для соответствующих им хлорофиллов.Во 36Необходимо выбирать Л, ирегтакими, чтобы и флуоресценцияфеофитинов (феофитина в указанной паре пигментов) была бы достаточно большой. В противном случае сигнал может оказаться ниже порога обнаружения данным прибором.Диапазоны выбора 3 ",к, идля каждой пары феофитин -хлорофилл корректируются с учетом диапазонов двух других пар пигментов.Ширина полос возбуждения и регистрации должна быть достаточно боль" шой, чтобы иметь хороший рабочий диапазон концентраций с одной стороны, и достаточно малой, чтобы иметь хорошую селективность по каждому пигменту с другой.На фиг.1 - 2 представлены экспериментальные данные, снятые на спектрофлуориметре БЬМ- спектральный ход интенсивности флуоресценции чистых пигментов при различных условиях возбуждения.и регистрации и рассчитанные на этой основе значения кислотных факторов К, т.е. отношений ой ке На основе полученных экспериментальных данных имеем, что для хл а - фео а К ф наиболее целесообразно выбирать в диапазоне 5-15. Учитываязначения Л", (хл а) " 432 нм, и(фео а) = 411 нм (см.табл,1),моксполучим, что для пары хл а - фео аВОЕШЬЛ ме необходимо выбирать в диапаэо 5 1473518бне 430-440 нм; при Л ьо ) 440 нм на- приблизились бы к Л 6"6 (хл а), иблюдается спад Га (хл а) и мы подхо- кроме того при Л,.,448 ни очень возрастает кислотный фактор (К с, станони, а принится больше 100), что снижает точ"( 430 нм К станонится меньшеьсзб Фность определения этих пигментов.5. В указанный диапазон попадаетДпя полосы регистрации интенсивносЛ "сгф (фео в) = 436 нм и с. учетои ти флуоресценции аналогичным обрамаксзом имеет диапазон 636-640 нм, прир попадает Л (фео с) 1 Ое 636 нм велик Кф, при Л ) 640 нм, 429 нм (см. табл,). Поэтому для близко подходим к максимумам флуоресуменьшения влияния фео в и фео с не- ценции других пигментов (хл в ирег фео в).обходимо сдвинуть диапазон МР памаке : При проведении подобных флуориры хл а - фео а отфр (фео в и 15 метрических измерений важное эначеМаксние имеет величина ширины полосыфео с) 659 нм; для пары хл а - фео апропускания, которая обычно указырсгпринимаем диапазонае равный . вается по уронню 0,5 от максимума670-676 нм.Ьоэб рсг(т.е. йЯ 4 6 и ВЛ и 5 ). Значения спекНа основе полученных экспериментральной ширины полос возбуждения и, тальных данных имеем, что и для парырегистрации в данном случае выбираже наиболее целесообразно выбирать вются любыми приемлемыми с точки эредиапазоне - читьы жж" " 25 прибором, но. Они не должны преныД(хл в)460 нм, и Л " (фео в)= шать 12 нм по следующим причинам.= 436 им, получим, что для пары хл в -Расстояния по шкале длин волн воэ",ф ф буждения мвкду установленными диапафео в Д, необходимо ныбирать в зонами выбора, Л для хл а - фео а и хл.30диапазоне 458-465.нм; при 16)465 нм с-феос равно 4 нм, между диапазонамикислотный фактор К 4, возрастает и пре- хл с - фео с и хл в - фео в10 нм,вышает К,1, = 5, при Д 6, 6458 нм Расстояние по шкале длин волн реК 4 становится меньшим 5, и поэтому гистрации между указанными в .формулевне этого диапазона (458-465 нм) нырегдиапазонами выбора Л для, хл сВоэ 6бнрать 1нецелесообразно. Для фео с - и хл в - фео и равно 13 ни,а между диапазонами хл в - фео в нполосы регистрации интенсивностифлухл а - фео а " 11 нм Таким образом,оресценции. с учетом того же требоваесли спектральная ширина полосы возния 5 еК ф15. имеем диапазон 649663 ни, а чтобы иметь достаточное40 . буждения и регистрации (по уровню0,5) больше 12 нм, то перекрывать"удаление от Ь (хл с) слева и от ся будут .и полосы возбуждения и по"лосы регистрации. Поэтому целесообхл а справа, имеем окончательно возб рсгразно выбирать йЛ,6 и дЛ 6 мень"рсгдиапазон6, (хл в, фео в) равный 45 ше 2 нм, нижнее значение этой ве 653"659 ни.личины определяется в зависимостиот типа прибора, на котором осущестчеи селективность системы будет больбольше, чем в предыдущих двух слу- . 5 О ше, но с другой стороны, однонременаях. Учитывая, чтое (хл с) а но будет уиеньшаться диапазон кон 446 йм, а Д , (фео с)429 нм, . центраций, измеряемых на выбранномпол ч Л 6436приборе так как ухудшается соотнополучииу что Л макс необходимо вышение сигнал/шум,бирать в диапазоне 444-448 нм при бб. Пример выполнения.18"( 444 нм мы существенно бы при, ВеЭ 6 гблизились к 4 , (фео в и хл а),Была проведена градуиронка спек"СЬ К 4 акЕ (фф трофлуориметра ЯЕМн на нема при 6 с ) 448 нм - существенно определялись концентрации пигментов1473518 Э Р 671 нмР 654 нм638 нм,Система уравнений, которая использовалась. для отыскания градуировочных уравнений, имеет следующий вид: до подкисления15 до подкисленияР, - КС + К,-СГ- КС+ К, С+ф "К Со+К С+ь ьКфьС,+ К,.СФстКфьсфь+ К фсфаКф,сфь+ Кф,сфс3 к, с, + к,.сф.+ Сс Кфасфф зС " а, ЬР + а дР + аз дРСЬ Ь, гГ + ЬЗР + ЬЗГ11С =с, дР +сдР +с дРСф, аГ е аГ + аР- (а ДРС- ЬГ.+ ЬР+ Ь,Г - (Ь,В РСф с,Р + сф+ сР - (с, ЛРГ, Р- величины интенсивности . 4 Офлуоресценцин исследуемо.го раствора при различныхусловиях (д=1,2,3),Р " интенсивность флуоресценцнн исследуемой пробы при1.-х условиях возбужденияи регистрации (до подкисления),Р - то же после подкисления.ЙРГо ГкС - молярная концентрация соответствующего пигмента- длины волн максимумов возбуждения и соответственно регистрации бы" ли следующими:1 озбЛмакс " 446 нм- ширина полосы пропускания и повозбуждению и по регистрации (поуровню 0,5) - 8 нм; после подкисления1 /фРК 1 С К С + К,С111Кфа С ф Кфьс Фь Кфс С фсЬ Ь1 з фКфюС фц+ КфЬ Сфь+ КфсС фсСф С + Сф; Ц а,Ь,с)Решение этой системы- размер кюветы в плоскости измерения 1 см. 1 см; объем пробы 4 мл;- пробы подкислялись тремя каплями раствора соляной кислоты (рН= 0,7)1- время между подкислением и иймерением составляло не менее 3 мин,ная интенсивность флуоресценцни пигмента при 1;-хусловиях измерения. а 1 - с; - коэффициенты градуировочных уравнений (Х),полу"чаемые рипением системы(1) относительно неизвестных Спосле подстановки в (1) 18"ти измеренных коэффициентов К пнемПроведя градуировку прибора, т.е. определив удельную интенсивность флуоресценции пигментов при всех трех условиях измерения (К)-,. вычис-. ляли,коэффициенты а; - е ; системы Д 1). Чтобы определить концентрации пигментов в исследуемой пробе (С , )мам у для этой пробы измеряли трижды (при трех различных условиях возбуждения и соответственно регистрации) интен9 4735сивность флуоресценции пробы до (Р,)и трижды после подкисления (Р ) еекаплями соляной кислоты. Подставляя1значения Ри аР в систему (11),ивычисляли концентрации пигментов впробе.Результаты градуировки приведеныв табл.2 и 3,Для контрольных растворов чистыхпигментов и их смесей в рабочем диапазоне концентраций отличие между.значениями концентраций для всех хлорофиллов, фео а и фео в, определенными описанным флуоресцентным способом, и их истинными значениями, составляет менее 57., а для фео с ме-нее 8,53,Таким образом, предлагаемый способ более точен, чем известные, так 20как, во-первых, ошибка определениякаждого пигмента меньше, чем у пре дыдущих, во-вторых, способ работоспособен и эффективен в общем случаелюбого соотношения между хл а,в,сн фео а, в,с, т.е, применим для любых природных вод.Кроме того, предлагаемый способ прост с точки зренияприборной реализации, так как позволяет использовать не только спек-, 30трофлуориметры, но и флуорнметры. ТаблицаМаксимумы поглощения и флуоресценции фо". тосинтетических пигментов в 907-ном ацетонею аввйвВ Ев ювПигмент Поглощение Флуоресценция ммс Лс унм,нм хл а 432 фео а 41 хл в . 460 фео в 436с 446.429 671 674654 659 39 659 хл фе Формула изобретения Способ определения концентрации хлорофиллов а,в, с, и их феофитинов, включающий приготовление экстракта пигментов в 903-ном водном ацетоне, возбуждение и регистрацию интенсивности флуоресценции до и после. под-. 4018 10кисления раствора, причем измерение интенсивности флуоресценции до подкисления проводится при трех различных условиях регистрации, расчет концентрации пигмента по величине интенсивности, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности за .счетвыбора оптимальных условий возбуждения и регистрации н расширения круга анализируемых объектов, возбуждение флуоресценции раствора до подкисления проводится при1 трех различных условиях возбуждения, возбуждение и регистрация флуоресценции после подкисления проводится при тех же условиях, что и до подкисления, причем условия возбуждения и регистрации устанавливаются так, чтобы удовлетворялось неравенство для хлорофиллов а и в: 5Р/Р 45, и для хлорофилла с: 50РРс 150, где Ро и Ринтенсивность флуорес" ценции чистых пигментов до и после подкисления), прн этом первый раз при измерении интенсивности преимущественно пары хлорофилл а - феофитин а длину волны. максимума возбуждения устанавливают в диапазоне 430- 440 нм, а соответствующую ей длину волны максимума регистрации интенсивности Флуоресценции в диапазоне 60-676 нм, второй раз при измерении преимущественно пары хлорофилл вфеофнтин в - соответственно в диапат зонах 460"465 нм и 653-659 нм, тре-тий раз при измерении преимущественно пары хлорофилл с - Феофитинс " соответственно в диапазонах 444- 448 нм и 636-640 нм.473518 70 й 70 Кгг/л фиг Заказ 156 пнсн раж 51 НКИПИ Гос ГКНТ С арственного комитет 113035, Иосква,нт", г, Уагород, ул. Гагарина,30 инат оизводственно-издательск Составитель О,БадтиеваРедактор В.фельдман Техред И.Верес Корректор Л. Зайцева зобретеииям и открмтия Рауюская наб., д. 4/5 АМян. он. еР