Способ хранения биологических проб животного происхождения для определения глутатиона

СОЮЗ СОВЕТСКИСОЦИАЛИСТИЧЕРЕСПУБЛИК Х 9) 5)4 С 01 Л фиаота ЕНИ ЬСТВ 57/28-13.А.И.К 5(088.8) В 1 осЬетп. 1968 3 ф ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЦТИ ПИСАНИЕ ИЗ К АВТОРСКОМУ СВИД(54)(57) СПОСОБ ХРАНЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОБ ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛУТАТИОНА путемпредварительного обезбелачиванияпробы сульфосалициловой кислотой,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, сцелью увеличения сроков хранения, вобезбелаченную пробу добавляют 0,651,0 кратный объем 510 тМ растворахлористой ртути с последующим доведением рН реакционной смеси до 2,56,0.Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано при диагностических исследованиях.Целью изобретения является уве личение сроков хранения.П р и м е р 1. К О, 1 мл цельной гепаринезированной крови крысы добавляют 0,6 мл 103-ного раствора сульфосалициловой кислоты (1;6), 10 Смесь перемешивают и после 10-минутного стояния центрифугируют при 5000 об/мин в течение 10 мин. Объем надосадочной жидкости считается равным сумме объемов соответствующих И компонентов (0,7 мл). К нему добавляют равный объем (0,7 мл) 5 10 Ъ раствора Н 8 С 2 и затем устанавливают рН реакционной смеси до 4,0 0,1 н раствором ИаОН или Са(ОН)Пробу 20 хранят в плотно закрытом флаконе 60 дней. Избыток НСУ , не вошедшего с глутатионом в реакцию, определяют обратным амперометрическим титрованием 1 10 М раствором цистеина. 25По разности между внесенным количеством Н 8 СР и оттитрованным в конце определения находят содержание глутатиона в пересчете на 100 мл цельной крови по Формуле 30100 ( Ч -Чо)Ъгде Я - содержание глутатиона на100 мл цельной крови, мкмоль,Ч . - объем 510 М раствора НяСР, З 5-4предварительно добавленногок цельной крови, млЧ - объем 5 10 М раствора НяСР,непрореагировавшего в реакционной смеси, определяемыйграфическим путем, мл,"Ч, - объем цельной крови, взятойдля анализа;500 мг ткани почки крысы гомогенизируют с 4 мл 10 Ж-ного раствора сульфосалициловой кислоты (1:8). Смесь перемешивают при 5000 об/мин в течение 10 мин. Объем надосадочной жидкости равен сумме объемов соответствующих компонентов (500 мг : 0,5 мл, Ч=0,5 мл+4,0 мл=4,5 мл), к нему добавля-, ют 3,5 мп 510 М НяСУ и затем устанавливают рП реакционной смеси до 4,0 О, 1 н раствором КаОН или Са(ОН),. Пробу хранят в плотно закрытом Флаконе 60 дней. Затем избыток ионов Ня , не вошедших в реакцию с глута 2 Ф тиономопределяют обратным амперо-э метрическим титрованием 1 10 М раствором цистеина.По разности между внесенным количеством Н 8 СХ и оттитрованным в конце определения находят содержание глутатиона в пересчете на 100 г ткани по формуле100 (Ч -Ч)ЯьОогде Я - содержание глутатиона на100 г ткани, мкмоль,Ч - объем 5 10 М раствора НВОСУпредварительно добавленногок гомогенату тканей, мл,Ч - объем 5 10 М раствора НВОСУ,непрореагировавшего в реакционной смеси, определяемыйграфическим путем, мл,, - вес навески тканей.Испытуют содержание глутатиона вразных пробах животного происхождения и при других сроках хранения.Влияние сроков хранения пробы наопределяемость глутатиона (М + т)представлены в табл. 1,Как явствует из данных, химическая обработка биологических проб животного происхождения раствором НдСХ позволяет хранить их с перво 2начальным уровнем глутатиона в течение 100 дней.П р и м е р 2, К 0,1 мл цельной гепаринезированной крови крысы добавляют 0,8 мл 107-ного раствора сульфосалициловой кислоты. После перемешивания и 10-минутного стояния смесь центрифугируют при 5000 об/мин в течени 10 мин. К ней добавляют 0,6 мп 510 М раствора НяСР, устанавливают О, 1 н раствором ИаОН рН реакционной смеси 4,5. Пробу хранят в плотно закрытом флаконе 180 дней. Содержание глутатиона в пробе находят так как описано в примере 1. Выбор оптимальных соотношений между объемом надосадочной жидкости и раствором 5 10 М НВОСУ (М + н 1) представлен в табл. 2. Полученные результаты свидетельствуют о том, что при химической обработке надосадочной жидкости 0,65-1,0 кратными объемами 5 104 М раствора НСР данные о содержании глутатиона во время хранения проб (180 дней) статистически%недостоверно отличаются от данных до хранения пробы, что является оптимальным интервалом соотношений объема надосадочной жидкости и НВОСУ2 (наьрс, ли,. Ч ПЯСТЬ= 1 е (О, 65-1, О),П р и м е р 3. 100 мг тканипечени крысы гомогенизируют прио0-4 С с 1 мл 103-ного раствора сульфосалициловой кислоты при 800 об/мин в течение 1,5 мин, После 10-минут О ного стояния суспензию центрифугируют при 5000 об/мин в течение 10 мин. В надосадочную жидкость добавляют равный объем 5 1 бМ раствор Н 8 СЮ и 0,1 раствором БаОН или КОН, или .15 Са(ОН) устанавливают рН реакционной смеси 1,5; 2,0 2,4 2,5; 3,5, 4,5; 6,0; 6,2; 7,0; 8,0110,0. Смесь хранят в плотно закрытом флаконе 180 861 4дней и затем определяют содержание глутатиона как описано в примере 1,Во всех исследованных тканях крыс(печень, почки, легкие, мозг, надпочечник) при рН меньш. 2,5 получаются заниженные, а при рН больше 6,0 - завышенное дбдержание глутатиона по отношению к данным полуФченным до хранения пробы. В интервале рН 2,5-6,0 найденные данные о содержании глутатиона в тканях крыс при хранении пробы до 180 дней недостоверно отличаются (р0,05) от данных по содержанию в тканях крыс до хранения пробы. Этот интервал рН (2,5-6,0) является оптимальным в предлагаемом способе хранения биологических проб животного происхождения для определения глутатиона.+ Б Ф 0л + в 1 л СО л 3 +1 0 СЧ СЧ л 00 +1 ОО СЬ СЧ л1168846 Линейные индексы удерживания (3) Кислоты и виде соответствуЮщих эФировИзвестный способ 72,9+3,40 17,6+1,50 б,б 4,7 63,22+1,5 Щ;л 2,8 8,5 Средняя погрешность измерений 11,2 С, 54,47+3,60 Продолжение табл.4 Предлагаемый способ