Способ идентификации субпопуляций лимфоцитов

(9 18 3)5 6 01 й 33/ ЕИ ОБРЕТЕ ЦИИ СУБПО- е,а именно в етения: один повышение точнопуляций лимфоциГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНВЕДОМСТВО СССР(56) Цой И,Г, и др. Стабилизированныйдиагностикум для идентификации Т-супрессоров методом комбинированного розеткообразования. Лабораторное дело,1987, Ь 12, с 919-921.ф 4) СПОСОБ ИДЕНТИФИКАПУЯЯЦИЙ ЯИМФОЦИТОВ(57) Использование; в медйциниммунологии, Сущность изобр Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии,Идентификация лейкоцитов, особенно лимфоцитов, по их мембранным рецепторам и антигенам - одна из важнейших задач экспериментальной и клинической иммунологии.Цель изобретения -сти идентификации субпотов.Способ осуществляют следующим образом, Смешивают равные обьемы 5-25 взвеси фиксированных эритроцитов и 0,1- ного раствора красителя, Смесь выдерживают в кипящей водяной бане в течение 60-90 мин, Окрашенные эритроциты трехкратно отмывают забуференным, рН 7,2 0,85-ным раствором хлорида натрия, Технология этоиз фиксированных эритроцитарных реагентов предварительно окрашивают 0,1;4-ным раствором одного из красителей (ализариновый желтый, амидочерный, хризоидин, зозин натрия, эритрозин, кристаллвиолет), окрашенные эритроциты отмывают, используют вместе с неокрашенным эритроцитарным реагентом в розеткообразовании, приготовленный затем мазок фиксируют в ацетоне в течение 4,9 - 5,1 мин при комнатной температуре. Способ дает возможность дифференцировать лимфоциты и моноциты между собой и мононуклеары каждого. из этих типов по двум маркерам одновременно. 4 табл.го этапа соответствует способу прототипа, но в качестве красителя используют один из перечисленных выше красителей. Проводят д смешанное розеткообразование в обще- ЬЭ принятом режиме с применением двух зрит- фь, роцитарных реагентов - неокрашенного и, со предеарительно окрашенного. Затем гото- ( ) вят мазок, который фиксируют химически чистым ацетоном в течение 4,9-5,1 мин, при комнатной температуре (15 - 25 С). Фиксированный мазок окрашивают по Романовскому-Гимза. Окрашенный эритроцитарный реагент под микроскопом имеет фиолетовую окраску (при использовании всех перечисленных, кроме хризоидина, красителей) или желтую (при использовании хризоидина) окраску, Другой эритроцитарный реагент (неокрашенный) имеет красный цвет, арозово-фиолетовые моноциты и лимфоциты различаются морфологически. Возможны следующие варианты маркирования розеткообразующих клеток: лимфоцит не связал оба эритроцитарных реагента (количество авязанныхлимфоцитом эритроцитов каждого из реагентов не превышает двух) - такой лимфоцит не имеет ни одного из двух определяемых маркеров; лимфоцит связал не менее трех эритроцитов неокрашенного реагента (для маркера 1) и не более двух эритроцитов окрашенного реагента (для маркера 2) - такой лимфоцит имеет маркер 1 и не имеет маркера 2; лимфоцит связал не более двух эритроцитов неокрашенного реагента и не менее трех эритроцитов окрашенного реагента - такой лимфоцит имеет маркер 2 и не имеет маркера 1; лимфоцит связал не менее трех эритроцитов каждого из двух реагентов (неокрашенного и окрашенного) - такой лимфоцит имеет оба маркера.Сходными с прототипом признаками являются: 1. Применение для идентификации путем смешанного розеткообразования одного из предварительно окрашенных эритроцитарных реагентов.2. условия окраски эритроцитарного реагента,Существенным отличительным признаком является применение других красителей для предварительной окраски фиксированных эритроцитов и другого способа фиксации мазка, что обеспечивает возможность визуальной дифференциации в мазке разных эритроцитарных реагентов в розетках и морфологической дифференциации лимфоцитов и моноцитов,П р и м е р 1. Сравнение предлагаемого и известного способов. По предлагаемому способу: а) окрашивают бараньи фиксированные ацетальдегидом эритроциты амидочерным (или любым другим из перечисленных красителей) путем смешивания равных обьемов 10 ф взвеси эритроцитов и 0,1раствора красителя, выдерживают смесь при периодическом встряхивании в течение 60 мин в кипящей водяной бане, отмывают эритроциты забуференным (рН 7,2) 0,85 раствором хлорида натрия (режим этого этапа - как в известном способе). б) готовят смесь эритроцитарных реагентов для розеткообразования, соединяя равные объемы взвесей окрашенный эритроцитов барана и эритроцитов быка, сенсибилизированных антителами, каждая из которых содержит 2,4 х 10 клеток в 1 мл. в) соединяют полученную смесь и взвесь выделенных лимфомононуклеаров, содержащую 2 х 10 клеток в 1 мл, в6равных обьемах. Полученную смесь выдерживают 5 мин при 37 С, центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин и дополнительно инкубируют 1 ч при 4 С) готовят мазок, сушат его при комнатной температуре и фиксиру ют в ацетоне в течение 5 мин при комнатнойтемпературе. д) после высушивания мазка его окрашивают по Романовскому-Гимза и под микроскопом подсчитывают содержание моно- и смешанных розеток, Опыт про веден при обследовании 5 доноров.Предварительное осуществление способа точно по описанию прототипа (учет в камере Горяева) не позволило дифференцировать лимфоциты и моноциты. Поэтому 15 способ прототипа, с целью обеспечениядифференциации лимфоцитов и моноцитов, использован в варианте учета розеткообразования в мазке, На этапе а) фиксированные ацетальдегидом бараньи эритроциты окра шивают 0,10 -ным раствором генцианвио-,лета, на этапе г) мазок фиксируют 96 метанолом. Остальные этапы выполняют - как описано выше. Способ применен при обследовании тех же 5 доноров. Получен ные результаты приведены в табл. 1.Определение розеток для каждого обследуемого при применении предложенного и известного способов проводили раздельным подсчетом 7 сотен лимфоцитов.30 По известному способу дифференциациярозеток с Е бар. и ЕА в мазке невозможна, эти эритроциты одинаково окрашены в розовый цвет, поэтому нельзя определить, какой реагент связан, По предлагаемому 35 способу удалось, благодаря возможностичеткой дифференциации Е бар. и ЕА, определить специфические моно- и смешанные (двойные) розеткообразук)щие лимфоциты.П р и м е р 2, Выбор красителя для 40 предварительного окрашивания эритроцитов, Фиксированные эритроциты окрашивали одним из следующих красителей: влизариновый красный, ализариновый желтый, метиловый красный, нейтральный 45 красный, кислотный хромтемнокислый, ре зазурин, иодэозин, аурофосфин, амидочерный, хризоидин, зозин натрия, родамин, кристаллвиолет. Все этапы выполняли - как описано в примере 1 для предлагаемого 50 способа. Результаты приведены в табл. 2. Видно, что из использованных красителей четкое отличие окраски двух эритроцитарных реагентов - предварительно 55 окрашенного и не окрашенного обеспечивают; ализариновый желтый, амидочерный, хризоидин, зозин натрия, эритрозин, кри-.сталлвиолет.П р и м е р 3. Выбор способа фиксациимазка.фиксированные ацетальдегидом эритроциты барана окрашивали (отдельные порции) каждым из следующих красителей: ализариновый желтый, амидочерный, хризоидин, эозин натрия, эритрозин, кристалл- виолет - как описано в примере 1 для предлагаемого способа,Фиксацию мазка осуществляли одним из следующих методов: 10% раствор А 9 ИОз (10 мин), 96 этанол (30 мин), смесь Никифорова (30 мин), 96 метанол (15 мин), ацетон (5 мин). Все остальные этапы выполнены - как в примере 1 для предлагаемого способа, Результаты приведены в табл,З. Видно, что отличие в мазке двух эритроцитарных реагентов (окрашенных и не окрашенных предварительно) обеспечивают, в зависимости от использованного для предварительной окраски красителя, разные фиксаторы. Но наиболее четкие и для большего числа красителей результаты получены при фиксации мазков ацетоном. Видно, что при фиксации мазков 96 метанолом эффективной по четкому различию цвета оказалась только предварительная окраска эритроцитов амидочерным. При фиксации мазков ацетоном столь же эффективна предварительная окраска эритроцитов любым из 6 использованных в этом примере красителей. С учетом высокой токсичности метанола и возможности более широкого выбора красителей для предварительной окраси эритроцитов при фиксации мазков ацетоном методом выбора при фиксации мазков является обработка их ацетоном, Преимуществом такой фиксации является одинаковая для большинства подобранных красителей окраска в мазке предварительно окрашенного эритроцитарного реагента.П р и м е р 5. Проверка специфичности адгезии окрашенных эритроцитов, Важно проверить, влияет ли предварительная окраска фиксированных ацетальдегидом эритроцитов на их адгезионную способность в розеткообраэовании. Проверку осуществляли, используя фиксированные ацетальдегидом эритроциты кур, практически лишенные адгезивных свойств. и такие же эритроциты барана, активно участвующие в спонтанном розеткообразовании, 5 При исследовании мононуклеаров больных оценивали влияние предварительного скрашивания этих эритроцитов кристаллвиолетом на их связывание лимфоцитами (таб. 4),Видно, что предварительная окраска 5 фиксированных эритроцитов не изменила их адгезивных свойств (не увеличила и не снизила). Следовательно, специфичностьрозеткообразования с окрашенными попредлагаемому способу эритроцитами сохраняется.5 П р и м е р 6, Выбор длительности фиксации мазка ацетоном, Предлагаемый способ осуществляли как в примере 3, прииспользовании красителя кристаллвиолетаи различной длительности фиксации мазков10 ацетоном - 1, 3, 5 и 10 мин. Точность регистрации экспозиции при фиксации +5-6 с,Получены следующие результаты. Фиксация мазков в течение 1-3 мин не обеспечивает четкой цветовой дифференциации15 неокрашенных и предварительно окрашенных эритроцитов. Фиксация мазков в течение 10 мин приводит к разрушениюнекоторых мононуклеаров.Следовательно, оптимальной длитель 20 ностью фиксации мазков является 5 мин, ас учетом точности регистрации экспозиции5,0.ф.0,1 мин,Таким образом, разработан способидентификации субпопуляций лимфоцитов25 смешанным розеткообразованием с эритроцитарными реагентами, позволяющий использовать эритроциты, не различающиесяморфологически. Способ может быть использован для идентификации лимфоци 30 тов по наличию двух различныхмаркеров, например, по рецептору кэритроцитам барана и Гс фрагменту 96,или по анти генсвязывающему рецептору ирецептору к эритроцитам барана и т,п, Кро 35 ме того, поскольку учет розеткообразования,выполняется в мазке, а предлагаемый способ позволяет четко дифференцироватьлимфоциты и моноциты по морфологии,предлагаемый способ обеспечивает диффе 40 ренциацию различных розеткообразующихмононуклеаров.Формула изобретенияСпособ идентификации субпопуляцийлимфоцитов путем проведения реакции ро 45 зеткообразования с окрашенными и неокрашенными эритроцитами барана споследующим микроскопическим исследо. ванием полученных препаратов, о т л и ч аю щ и й с я тем, что, с целью повышения0 точности способа, окраску эритроцитов осуществляют 0,1 о -ным раствором или ализаринового желтого, или амидочерного, илихриэоидина, или эозина натрия, или эритрозина, или кристаллвиолета, а микроскопиче 5 ское исследование проводят на мазке,фиксированным в ацетоне в течение 4,9-5,1мин при 15-25 С.1812493 Таблица 1 Возможности предлагаемого и известного способов. лица ор краси предварительно не окрашенныхредварительно окраш ы КрасныТот ж Красн оричневы Красный То Резазурин Иодэозин оричневый же АурофосфинАмидочерный" Фиолетовы Хризоидин" Эозин натрия" и ЖелтыйФиолетовы 3 ритрози и Родаминисталлвиолет"- пригодные для предлагаемого способа крас аситель для эритроцитарного агентазариновый красныйзариновый желтый"Сафранинетиловый красный Нейтральный красный Пиронин ислотный хромтемнокислыйЦвет эритроцитовв фиксированном и окрашенном мазкеРозовыйиолетовыйРозовый Тот же Розовый Фиолетовы,е аФ Щс 2о ф9 й ре 5 З 2 а ф о ЪС Ф М ф оЗ е 3 З З ф :г а О х ао ьЗ аЗ оМ Ф 2 Ф Х 5 Фа р ф а ф Х оа о фФ А О Ф 2З З ф о Ф Ф 5 аа с Ф 1 11812493 12 Таблица 4 Отсутствие влиянияпредварительного окрашивания фиксированных эритроцитов на их связывание лимфоцитами, Р - вероятность ошибки при сравнении окрашенных и неокрашенных эритроцитонд - не делали. Составитель Б, КаральникТехред М. Моргентал Редактор Корректор Т. Вашкович Заказ 1573 . Тираж ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Т Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 10