Способ размножения винограда

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИ(ЕСКИХРЕСПУБЛИК 53 А 19) (11 15)5 А 01 Н 4/00 ИС ИЕ ИЗОБ ТЕН К АВТОРСКО ВИДЕТЕЛЬСТа Сь 0 Изобретение зяйству, в част изолированных жет быть испол вегетативно раз Известен сп ний (п чТго, вкл изолированной т в контролируем для повышениясадке в нест онный сосуд риалом в в толщиной 20Недоста ляются затр ний, а также требующих 3 нение и ада грунта,ерильныепокрываиде терм- 25 мкмтками изаты наневысоконачительптацию к условия культивациют полимерным матеоусддочной пленк вестноговыращиве качестных затрусловия способа явание растево растений, ат на их храм открытого ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИРИ ГКНТ СССР 1(71) Всесоюзный научно-исследовательский институт винограда и продуктов его переработки "Магарач"(56) Авторское свидетел ьство СССР М 1400557, кл. А 01 Н 3/00, 1988.Методические рекомендации по клональному микроразмножению винограда, - Ялта: ВНИИВ и ПП "Магарач", 1986, с. 23 - 24.(54) СПОСОБ РАЗМНОЖЕНИЯ ВИНОГРАДА (57) Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к культивированию изолированных растительных тканей, и мо жет быть использовано при производстве вегетативного размножаемого винограда. Целью изобретения является увеличение выхода растений и приживаемости их в не- стерильных условиях, Поставленная цель достигается тем, что проводят высадку меристематических верхушек на питательную среду Мурасиге-Скуга, культивируют до получения растений-регенерантов, микрочеренкуют и высаживают микрочеренки для относится к сельскому хоности к культивированию растительных тканей, и моьзовано при производстве множаемого винограда. особ выращивания растеючэющий культивирование кани на питательной среде ых условиях, по которому приживаемости при переукоренения и доращивания, после чего их хранят и пересаживают в нестерильные условия, при этом доращивание осуществляют при 8-часовом фотопериоде до вызревания не менее одного узла побега. Укоренение и доращивание осуществляют на питательной среде, содержащей, мг: аммоний азотно-кислый 318,0; калий азотно-кислый 950,0; магний серно-кислый семиводный 233,0; калий фосфорно-кислый однозамещенный 250,0; кальций хлористый 331,0; борная кислота 1,6; марганец серно- кислый пятиводный 6,0; цинк серно-кислый семиводный 2,2; калий иодистый 0,21: кобальт хлористый шестиводный 0,006; натрий молибденово-кислый двуводный 0,6; медь серно-кислая пятиводная 0,006; железо серно-кислое семиводное 7,0; натрий - ЭДТА 9,3; мезо-инозит 20,0; никотиновая кислота 0,5; гумат натрия 30,0; сахароза 10000 и агар-агар 7500 на 1 л среды. Способ позволяет увеличить приживаемость растений в нестерильных условиях на 31%, хранить полученные укорененные черенки в течение продолжительного времени, снижает затраты труда на адаптацию растений при пересадке их в грунт. 1 з п.флы, 5 табл, 1695853Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является способразмножения. растений 1 и итго, включающий культивирование изолированной тканина питательной среде в контролируемых 5условиях до образования узлов побегов.Способ предусматривает последовательное выполнение стерилизации, высадки нажидкую или твердую питательную среду дляпролиферации почек и побегов, пересадку 10на среду укоренения, расчеренковываниена одноглазкавые эксплантаты с листьями, высаживание их на среду для укоренения до образования 4 - 10 узлов(листочков) и активно растущей верхушечной почки. Такие растения хранятдо высадки весной нэ адаптацию в теплицу в особыхусловиях - в культуральной комнате при 10 -13 С, освещении 1 - 2 тыс, лк на протяжении14 ч в сутки, влажности 70 - 8070, а при 20хранении более трех месяцев культуральныесосуды закрывают фольгой и дополнительнообворачивают парафином или пищевойпленкой. В теплицу растения высаживаются в вегетирующем состоянии с зеленой лозой и листьями, Первые 10 - 14 сут ихпритеняют и для увеличения влажности накрывают.Недостатками способа является низкоекачество получаемых растений, требующих 30в последующем проведения дорогостоящихи трудновыполняемых работ по хранению иадаптации их к условиям открытого грунтадля обеспечения приживаемости после посадк 1 и саженца на постоянное место. 35Цель изобретения - увеличение выходарастений и приживаемости их в нестерильных условиях,П р и м е р 1. Исходным материалом дляразмножения в культуре 1 п чтго служат интенсивно растущие зеленые побеги, взятыеиз кустов винограда сорта Подарок Магарача в мае - июне, а также из выведенной изсостояния покоя вызревшей лозы в осеннезимний период. В первом случае со здоровых кустов срезают побеги, которые затемзаворачивают во влажную фильтровальнуюбумагу и доставляют в лабораторию,В случае, когда исходным материаломслужит вызревшая лоза, в декабре нарезают лозу на 2-3-глазковые черенки длиной8 - 10 см, которые в течение 2 - 3 сутвымачивают при комнатной температуре врастворе р -индолилуксусной кислоты вконцентрации 2 мг/л, приготовленном на 55водопроводной воде, Затем черенки ставятна проращивание в растворе того же состава при температуре воздуха 25 - 30"С, Через 20 - 50 сут, в зависимости ат сорта и степени покоя лозы на черенках появляются зеленые побеги,Из полученных таким образом, либо доставленных с поля зеленых побегов отчленяют верхушки побегов размером 2 - 3 см и стерилизуют их в ламинарном боксе, За 10 - 15 мин до начала стерилизации бокс включают с целью выдувания пыли из рабочей зоны, а непосредственно перед началом работы поверхность бокса обрабатывают ватным тампоном, смоченным в 96%-ном этиловом спирте.Подготовленные верхушки побегов стерилизуют в течение 30 - 40 с в 700 -ном этиловом спирте, а затем 5 - 8 мин в диоциде, После этого простерилизованные верхушки помещают в стерильную дистиллированную воду для промывки от стерилизующих веществ, Воду сменяют 4 - 5 рэз на протяжении 10 - 15 мин.Работу по высадке исходных эксплантатов, а также по расчленению и пересадке агрегатов почек растений проводят в ламинарном боксе, С помощью глазных пинцета и скальпеля из побегов вычленяют апикальные меристемы с листовыми зачатками размером 0,5 - 0,8 мм и высаживают на мостики из фильтровальной бумаги в жидкой питательной среде М 1(табл.1. где приведены питательные среды, рекомендуемые для клонального микроразмножения и вызревания лозы винограда в условиях и ч 11 го) в биологические пробирки 22/200 и культивируют первую неделю при температуре +23 +28 С и освещают 800 - 1000 лк, а затем освещение увеличивают до 2000 - - 5000 лк, Пробирки закрывают фольгой и оборачивают пищевой пленкой толщиной 15 - 20 микрон.Через 20 - ЗО дней эксплантаты увеличивают в размере до 1 - 2 см. Их повторно пересаживают пинцетом в культуральные стаканы, содержащие слой жидкой среды М 2 (табл.1) толщиной 2 - 3 мм.Через 14 дней вырастают побеги длиной 3 - 4 см с 6 - 10 почками. Их извлекают пинцетом из культуральной посуды, кладут в стерильную чашку Петри и с помощью ножниц каждый побег расчленяют на 2 - 3 ч размером 1 - 2 см с 1 - 2 узлами и высаживают каждую отдельно на свежую питательную среду М 2.В течение следующих 14 дней на эксплантатах обрэзовываются многочисленные почки и побеги. Особенно интенсивно происходит пролиферация побегов из нижних узлов. В конце этого пассажа эксплэнтат представляет собой агрегат почек и побегов площадью 4 - б см, Его расчленяют2нэ 4 - 6 частей и пересаживают каждую5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 часть в стаканы на 200 мл, содержащие 10 - 15 мл среды Мг. Через 14 дней вырастают эксплантаты площадью 10 - 16 см, Ихг расчленяют на 5 - 7 ч и повторно высаживают на свежую питательную среду того же состава,Так как пересадки осуществляют два раза в месяц (через каждые 14 дней), каждый раз разделяя эксплантат на 5 - 7 ч (в зависимости от размножаемого сорта), следовательно, коэффициент размножения составляет 20 - 42 эксплантатов в месяц от одного исходного,Колбы и стаканы с высаженными эксплантатами устанавливают в культуральной комнате и через 8 - 10 дней после посадки делают отбраковку инфицированных куль- тур, Перед укоренением эксплантаты помещают на среду Мз (табл,1) с целью удлинения побегов,. После размножения достаточного количества побегов их отчленяют от агрегатов и высаживают на среду К для укоренения (табл,1). Из агрегата побегов площадью 10 - 16 см срезают 5 - 20 побегов. Укоренениегпобегов и развитие из них растений проводят при освещенности 3000 лк на протяжении 14 - 16 ч при 20 - 25 С в темновой и 25 - 30 С в световой периоды, Хорошо укореняются побеги размером 1,5 - 2,0 см с 3 - 6 листочками, Первые корни появляются через 4 - 14 дней,Через 2 мес у растений развивается по 8 - 10 новых узлов, Эти растения черенкуют на одноглазковые эксплантаты с лисв том, которые снова помещают на питательную среду К для укоренения, причем в биологические пробирки 22/200 (диаметр - 22 мм, длина - 200 мм) наливают по 6 мл среды. После того, как растения достигли высоты 10 глазков (т,е. после 2 мес культивирования на среде К у них образовалось 10 узлов) их продолжают культивировать при 8-часовом освещении интенсивностью 3000 лк при 25 С до вызревания не менее одного глазка побега, причем заканчивают культивирование при наличии в сосуде 0,5 мл питательной среды.Полученные растения помещают в подвал в условия без освещения, где хранят их при температуре в пределах от -1 до +7 С. Растения переходят в состояние зимнего покоя и хранятся до весны.Весной, в апреле, растения извлекают из пробирок, отмывают их корни от питательной среды и высаживают в количестве 20 - 30 шт. на 1 м на поливные гряды, вгсубстрат, применяемый для теплиц. Корни и нижние узлы растений присыпают, а верхний вызревший узел оставляют на уровне почвы. Растения поливают, не допуская подсыхания субстрата. Через 1 - 2 нед из почек начинают развиваться побеги, а к концу вегетации вырастают стандартные саженцы, пригодные для посадки на постоянное место в поле.Для определения оптимальной освещенности растений культивируемые на предлагаемой питательной среде и вегетирующие растения винограда 1 и ч 1 го с семью и более узлами побега освещают в течение 6, 8, 10 или 16 ч в сутки,Результаты испытания различных режимов фотопериода представлены в табл.2.Из данных табл.2 видно, что вызревание растений виноградаи ч 1 тго наиболее интенсивно проходит при освещении продолжительностью 8 ч в сутки. При освещении продолжительностью 1 - 5 или 17 - 24 ч вызревание растений 1 п ч 1 тго не наблюдается, что отрицательно сказывается на их приживаемости при адаптации.Для определения оптимальной степени вызревания растений культивирование проводилось после вызревания 1, 3, 5, 6 или 9 узлов побега, процесс культивирования прерывали и растения высаживали на адаптацию, Результаты экспериментов представлены в табл,З.Данные, полученные в табл,З, свидетельствуют о повышении приживаемости растений винограда с увеличением степени их вызревания 1 п ч 1 тго, Вызревание даже одного узла побега повышает приживаемость растений на 9, Оптимальным же следует считать вызревание у растений винограда 1 и ч 1 тго 7 - 9 узлов, В этом случае приживаемость составляет 81, что на 31 выше приживаемости растений с зеленой лозой.П е и м е р 2. Определение состава питательной среды для укоренения побе-. гов,Культивирование виноградных растений 1 и ч 1 тго (сорт Подарок Магарача) проводят так же, как в примере 1, но для укоренения эксплантатов используют питательные среды различного состава (табл.4),Кроме указанных в табл.4 компонентов, в каждую из сред были добавлены 1/4 раствора микроэлементов и 1/4 раствора Рехеллата.Результаты испытания сред представлены в табл,5, где прослеживается развитие растений, вызревание лозы и рост корней у растений винограда сорта Подарок Магарача 1 п ч 1 тго в зависимости от состава питательной среды,Из табл,5 следует, что питательной средой, имеющей оптимальный для вызрева, мг/л: и раствор готовятьных макрозлемент/л: ты, мг/л 5 Н 20НгО ния древесины растений состав, является среда 14.Необходимо отметить, что в отличие от растений 1 п чтго с зеленой лозой, такие растения можно хранить в течение продолжи тельного времени, Не менее важным их достоинством является и более высокая устойчивость к неблагоприятным факторам окружающей среды, в силу чего становится возможным значительно снизить затраты 10 труда при адаптации, одновременно получая высокий процент приживаемости качественного посадочного материала, оздоровленного от болезней и вирусов. Ф о р мул а изо б ретен ия1, Способ размножения винограда и итго, включающий высадку меристематических верхушек на питательную среду Мура- сиге-Скуга, культивирование до получения 20 растений-регенерантов,микрочеренкование и посадку микрочеренков для укоренения и доращивания, последующее хранение и пересадку растений в нестерильных услови 25 МакрозлементКНзКОзККОзМдЯО 4 7 НгОкНгР 04СаСг (маточндельно от остаЕе-хелат, мгГеЯ 04 7 НгОКаг - ЭДТАМикрозлемеНзВОзМпЯ 04ЕпЯ 04 7 КагМ 0042 НгОСОЯ 045 НгОСоСг 6 НОВитамины, мг/л:Мезо-инозитПарааминобензойная кислТиамин - ВгПиридоксин - НСНикотиновая кислотаАминокислоты, мг/л:ГлутаминГлицин ях, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью увеличения выхода растений и приживаемости их в нестерильных условиях, укорененные растения доращивают при восьмичасовом фотопериоде до вызревания не менее одного узла побега.2, Способ по п.1, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что укоренение и доращивание осуществляют на питательной среде, содержащей, мг: аммония азотно-кислого 318; калия азотно-кислого 950; магния серно- кислого семиводного 233; калия фосфорно-кислого однозамещенного 250; кальция хлористого 331; борной кислоты 1,6; марганца серно-кислого пятиводного 6; цинка серно-кислого семиводного 2,2; калия иодистого 0,21; кобальта хлористого аестиводного 0,006, натрия молибденово-кислого двуводного 0,6; меди сернокислой пятиводной 0,006; железа серно-кислого семиводного 7; натрия - ЭДТА 9,3; мезоиноэита 20; никотиновой кислоты 0,5; гумата натрия 30; сахарозы 10000; агар-агара 7500 на 1 л среды,1695853 Продолжение табл. 1 Среды М 1, Мг, Мз, - по известному спосо и получения вызревшей лозы винограда. ) Состав минеральных элементов по Мура блица лица Таблица 4 Пита. тельная среда, среда К - для укоренения растенииге - Скугу.1695853 Таблица 5 Составитель С, КуваеваТехред М,Моргентал Корректор О, Кравцова Редактор Е. Папп Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул,Гагарина, 101 1Заказ 4245 Тираж ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5