Способ выделения кишечных иерсиний

(504 С 12 ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН Ф1 нф ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬС(56) Авторское свидетельство СССРВ 988865, кл. С 12 Я 1/00, 1983.(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ КИШЕЧНЫХИЕРСИНИЙ(57) Изобретение относится к микробиологии. Цель изобретения - ускорение способа вьщеления кишечных иерсиний. Для приготовления питательного бульона используют 40,0-.50,0 гидролизата рыбного сухого, 0,005-0,02генцианвиолета, дистиллированную воду дол, После 24 - 48 ч вьщерживания засеянной жидкой среды в холодильнике пересев делают на чашку сосредой Эндо с добавлением генцианвиолета в концентрации 0,005 - 0,02.Засеянные чашки инкубируют в термостате при 22 - 26 С в течение суток. Затем делают пересевы из выросших бесцветных колоний на дифференциально-диагностическую среду, Эта среда содержит питательный агар сухой 35,0 - 40,0; сахарову 9,0 - 11,0;рамнозу 0,9 - 1,1; индикатор Андреда 38,0 - 42,0; дистиллированную воду до 1 л, Среду разливают в пробирки по 8 - 10 мл, стерилизуют в автоклаве при давлении 0,5 избыточной атомосферы и температуре 110 С в течение 30 мин. После стерилизации пробирки оставляют до застывания среды в слегка наклонном положении для получения "скошенного" столбика, Пей ресев колонии осуществляют уколом в э столбик и штрихами по поверхности скошенной части среды, Учет произво" дят после инкубации в термостате при 22 - 26 С в течение суток. Дифференцируют культурупо изменению цвета среды. При изменении цвета всей среды в пробирке до розового культура дифференцируется как 1 егвдпа епгегосо 1 хгдса, а при изменении только цвета столбика до розового - как 1 егв- п 1.а рвепйоГиЬегси 1 ов 1 в. 1 табл.50 Ф 12652Изобретение относится к медицине,а именно к микробиологии.Целью изобретения является ускорение способа выделения кишечныхиерсиний.5Способ осуществляют следующим об"разом.Для приготовления питательногобульона с генцианвиолетом используют гидролизат рыбный сухой, генцианвиолет и дистиллированную водупри следующем соотношении компонентов, г/л:Гидролизат рыбныйсухой 40-50 5Генцианвиолет0,005-0,02Дистиллированнаявода До 1 лДля приготовления исходного раствора генцианвиолета 1 г сухого порошка генцианвиолета растворяют в 100 млэтилового спирта, раствор хранят встеклянном флаконе с притертой пробкой при комнатной температуре (срокхранения до 1 года), Перед приготовлением питательной среды готовят рабочий раствор генцианвиолета, длячего в 1 л стерильной дистиллированной воды вносят 0,5 мл или 1 мл,или 2 мл исходного раствора генцианвиолета, в результате чего конечные, концентрации генцианвиолета составляют соответственно 8-10-20 мкг/мл.Добавление рабочего раствора генцианвиолета проводят после стерилизации питательного бульона по известкой методике,и остывания среды.Среда с генцианвиолетом являетсяодновременно питательной и селективной средой, так как генцианвиолетподавляет рост многих видов бактерий,кроме иерсиний, Эту среду можно использовать и в качестве консерванта,а также среды накопления, так какиерсинии сохраняют в ней жизнеспособность и размножаются в течениенескольких суток как в холодильнике(при 22 - 26 С).После 24-48 ч выдерживания засеянной жидкой среды в холодильнике,пересев делают на чашку со средойЭндо с добавлением генцианвиолетапри следующем соотношении компонентов, г/л:Агар Эндо сухой 40-50Генцианвиолет 0,005-0,02Дистиллированнаявода До 1 л 15 3Для приготовления среды из исходного спиртового раствора генцианвиолета, готовят рабочий водно-спиртовой раствор так же, как для жидкойпитательной среды и добавляют его вприготовленную по стандартной про"писи расплавленную среду Энда, которую после перемешивания и растворения генцианвиолета разливают в стерильные чашки Петри. Засеянные чашкиинкубируют в термостате при 22-26 Св течение суток и делают пересевыиз выросших бесцветных колоний надифференциально-диагностическую среду, содержащую питательный сухойагар, рамнозу, сахароэу, индикаторАндреде и дистиллированную воду приследующем соотношении компонентов,г/л:Питательный агарсухой 35-40Сахароза 9-11Рамноза 0,9-1,1Индикатор Андреде 38-42Дистиллированнаявода До 1 лСреду разливают в пробирки по 81 О мл, стерилизуют в автоклаве придавлении 0,5 избыточной атмосферы итемпературе 110 С в течение 30 мин.После стерилизации пробирки оставляют до застывания среды в слегка наклонном положении для получения "скошенного" столбика,Пересев колонии осуществляют уколом в столбик и штрихами по поверхности скошенной части среды ("косячка") . Учет производят после инкубациив термостате при 22 - 26"С в течениесуток. Дифференцируют культуру по изменению цвета среды: при изменениицвета всей среды в пробирке до розового цвета культура дифференцируется как 1 егв 1 пда епйегосо 11 йса, апри изменении цвета столбика до розового - как 1 егвп 1 а рвецс 1 оиЬегсц 1 овхв.П р и м е р 1, Фекалии больного(0,3-0,5 г) засевают в пробирку с питательным бульоном с генцианвиолетоми помещают в холодильник на 24-48 ч,Такой первичный посев лучше делатьв стационаре при поступлении больного до начала лечения, Затем производят высев иэ жидкой среды на чашку сосредой Эндо и генцианвиолетом, инкубируют посев в термостате при 22 о26 С, Через сутки на среде Эндо сгенцианвиолетом вырастают мелкие бес1265215 1 О цветные колонии, их пересевают надифференциально-диагностическую среду - скошенный столбик с рамнозой исахарозой, Посевы инкубируют в термостате при той же температуре сутки.Учет производят, оценивая цвет среды.Иерсиния энтероколитика изменяет цветвсей среды (и столбика и косячка) дорозового. Иерсиния псевдотуберкулеэис изменяет цвет до розового встолбике дифференциально-диагностической среды, а скошенная часть среды остается светло-желтой. Исследование серологических и других свойстввыделенных иерсиний проводится пообщепринятой схеме.П р и м е р 2. Пробу воды из открытых водоемов в количестве 5 млзасевают в 5 мл питательного бульонас генцианвиолетом и помещают в холовдильник при 4-6 С на 48 ч, Через двоесуток делают высев из жидкой средына чашку со средой Эндо и генцианвиолетом, которую помещают в термостат при 22-26 С на 24 ч. Дальнейшее 2исследование проводят так же, какпри посеве фекалий от больного.Для проверки чувствительности иточности способа проведены исследования по обнаружению кишечных иерсиний в микробных ассоциациях, включающих в разных сочетаниях следующиевиды: иерсинии; кишечную палочку,протей, шигеллу Зонне, стафилококк(стандартный штамм У 209), гриб кандида альбиканс, Посевные дозы иерсиний составляют: 10,100,1000 клетокна 1 мл, посевная доза ассоциантов -1000 клеток/мл.В таблице представлены результаты.количественного исследования по об"40наружению кишечных иерсиний в семиразличных микробных ассоциациях, проведенные параллельно по известномуи предложенному способам в динамике - через 1,2 и 5 сут при темпера 45туре холодильника и тармостата, где1 - иерсинии, кишечная палочка, стафилококк 209, 2 - иерсинии, кишечнаяпалочка, кандида альбиканс, 3 " иерсинии, кишечная палочка, шигелла Зон.11не, 4 - иерсинии, кишечная палочка,протей, 5 - иерсинии, кишечная палочка, стафилококк 209, шигелла Зонне,6 - иерсинии, кишечная палочка, ста"филококк 209, протей, 7 - иерсинии,кишечная палочка, стафилококк 209,шигелла Зонне, протей, кандида альбиканс,4Из таблицы видно, что при малойпосевной дозе (1 О клеток/мл) единичные колонии иерсиний выделяются иэ ассоциации через 5 сут только при использовании предложенного способа,а по известному способу их обнаружить не удается. При средней посевной дозе (100 клеток/мл) выявляютсядесятки колоний на чашке в результате инкубирования посевов при 2226 С в течение 2-5 сут и единичныеколонии - через 5 сут выдерживанияв холодильнике, по известному способу обнаружить иерсинии не удается нив одйом случае, При большой посевной дозе (1000 клеток/мл) предложенный способ является более чувствительным и эффективным, так как позволяет обнаружить во всех исследованных ассоциациях кишечные иерсинии в достаточном количестве ужечерез 1 и 2 сут после госева, послеинкубации при 22-26 С, в то времякак при использовании известногоспособа, в этих условиях иерсиниивысеваются через 5 сут, Иэ ассоциаций, выдерживаемых в холодильнике,единичные колонии кишечных иерсинийвысеваются уже через сутки и черездвое суток (14-18 колоний), а по известному способу они обнаруженычерез 5 сут и в количестве меньшем,чем по предложенному способу,Вторая серия контрольных опытовпоставлена с фекалиями, инфицированными кишечными иерсиниями. Инфицирующая доза кишечных иерсиний составляет 1 О , 1 О , 10 , 1 О , посевнаяР 3 4 5доза фекалий - 0,3-0,5 г,Способ позволяет выделить кишечные иерсинии при меньшей инфицирующей дозе (1 О ), что хорошо видно приинкубации посевов в термостате (выделение с первых суток) и в меньшейстепени - при выдерживании в холодильнике (выделение с третьих суток).Для оценки эффективности способавыделения кишечных иерсиний из объек"тов внешней среды исследована 125проба воды открытых водоемовСпособ обеспечивает выделение кишечных иерсиний из исследуемого материала при меньшем количестве исследований, сокращает время выдерживания первичного посева в холодильнике с 5-15 до 1-2 сут (для сточныхвод - 3-4 сут), ускоряет выделениечистых культур кишечных иерсиний отбольных и объектов внешней среды сСреднее количество выросших колоний при посевных дозах, клеток/мл Состав ассо 1 О 100 1000 10 100 1000 циа- ций Известный способ Предложенный способ Условия инкубации 22 - 26 С 1 сут 26,1+1,2 21,3+0,827,1+1,424,6+1,721,0+0,925,4+1,124,8+1,92 сут812+2 в 186,3+1,484,2+2,583,4+1,785,4+1,480,6+1,683,2+1,65 сут461,2+5,6475,3+5,2474,1+4,5468,4+4,8 16,1+0,6 11,4+1,4 14,5+О,8 15,2+0,6 16,5+0,4 11,4+0,8 14,2+0,6 12,1+0,5 14,2+0,4 1,2+0,8 15,4+0,9 61,4+0,4 59,2+0,8 63,2+0,9 69,8+0,9 5,3+0,2 7,4+0,6 5,7+0,3 бв 5+Ое 8 Ф 1265215 Ь15-17 до 5-7 сут, позволяет выделить Предложенный способ является бокишечные иерсинии при меньшей их кон- лее эффективным, чувствительным, точцентрации в исследуемом материале, ным и экономичным, чем известный,облегчает отбор колоний со среды Эн- Использование предложенного способадо с генцианвиолетом, так как они 5 возможно при исследовании материаповвырастают в количестве достоверно от больных, объектов внешней среды,большем, чем при использовании из- пищевых продуктов.вестного способа,1265215 Состав ассо 100 1000 10 100 1000 1 О цнаций Известный способ Предложенный способ 16,3+0,7 62)6+ОеЗ 462 еЗ+4 е 2 6,5+0,4 7 е 2+Ое 2 5,1+0,4 14,2+0,9 459,6+4,8 61,9+0,4 11,5+0,7 63,2+0,4 451, 3+4, 1С 1 сут 5,6+0,6 7,2+0,9 6,5+0,3 5,6+0,6 5,4+0,7 4,9+0,2 6,7+0,3 2 сут 15,3+0,6 18,6+0,3 14,5+0,8 16,5+0,3 15,4+0,7 17,5+0,4 15,4+0,6 5 сут59,6+0,3 63,3+0,8 51,4+0,8 6 е 5+Ов 4 7,4+0,9 5,6+0,2 6,3+0,8 8 е 3+02 16,2+0,3 3,3+0,2 17,4+0,1 14,3+0,2 18,5+0,9 54,3+0,4 58,3+0,4 Среднее количество выросших колоний при посевных дозах, клеток/мл1265215 Среднее количество выросших колоний при посевныхклеток/мл Сосассо Ф ВО 100 000 10 100 1000 циаций Предложенный способ Известный способ 5,6+0,7 61,4+0,8 7,6+0,5 6,5+0,4 60,4+0,7 -- 15,7+0,9 П р и м е ч а н и е. Выделенные из ассоциаций культуры.соответствуют исходным культурамиерсиний по морфологическим, культуральным, биохимическим свойствам иантигенной структуре,Составитель Е, ЯрныхТехред Л.Сердюкова Корректор М. Самборская Редактор Г. Волкова Тираж 490 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Заказ 5627/19 Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 формула изобретения Способ выделения кишечных иерсиний путем посева исследуемого материала в среду накопления, содержащую питательную основу, воду и селективный агент, с последующим выдержива.ием посевов при 4-6 С, пересевом и инкубированием на среде Эндо, выделением и идентификацией колоний, отличающийся тем, что, с целью ускорения способа, использу" ют среду накопления, содержащую в качестве питательной основы гидролизат рыбный сухой, а в качестве селективного агента - генцианвиолет35 при следующем соотношении компонентов, г/л:Гидролизат рыбныйсухой 40,0-50;0Генцианвиолет 0,005-0,02Дистиллированнаявода До 1 л,выдерживание посевов осуществляют в течение 24-48 ч, инкубирование на среде Эндо проводят в присутствии генцианвиолета в концентрации 0,005- 0,02 г/л в течение 1 сут, выделенные колонии дополнительно пересевают на скошенную питательную среду, содержащую агар сухой, сахарову, рамнозу, индикатор Андреде и дистиллированную воду при следующем количественном соотношении компонентов, г/л:Агар сухой 35,0-40,0 Сахароза 9,0-11,0 Рамноза 0,9-1,1 Индикатор Андреде 38,0-42,0 Дистиллированнаявода До 1 л идентификацию иерсиний проводят по изменению цвета среды, и при изменении окраски всей среды в розовый цвет, идентифицируют 1 егв 1 пда епегосо 1 с.са, а при окраске столбика среды - 1 егвдпда рвепйогцЪегсц 1 ов 1 в.