Реагент для идентификации вибрионов

СОЮЗ СОВЕТСНИХщамлюмщииРЕСПУБЛИК а С 12 а 1 ТЕНИЯ товни сследоваиологии рные бумаж брионов.НТИФИКАЦИИвысушенног ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙОПИСАНИЕ ИЗ ТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(71) Горьковский научнотельский институт эпидемикробиологии(56) 1. Системы индикатные для идентификации вТУ 4214-123-78 (прототнп.80.1129235 А бумажного носителя, пропитанного смесью пленкообразующего стабилизатора и индикатора, о т л и ч а ющ и й .с я тем, что, с целью упрощения количественного определения холерных вибрионов, в качестве носителя используют хроматограическую бумагу, которую пропитывают средой, содержащей сахарозу, желатину и индикатор, взятых в соотнощении 8-103, . 1-1,57. и 88,5-913, при этом в качестве индикатора используют диагнос" тическую сыворотку "0", "Огава", или "Инаба", или диагностический холерный айаг "С" или нЭль Тор".3количестве 1,3 мл каждого разведения на лист. Количество вносимых вбумагу сывороток рассчитывают сучетом получения титров антител,5участвующих в реакции агглютинации.инструкции). Через 20 мин листы бумаги покрывают стабилизатором -пленкообразующим полимерным покрытием - 17 поливиннловым спиртом вколичестве 0,7 мл и спустя 20 минпомещают в морозильный шкаф при -40 Сна сутки, Лиофилизацию проводят напротяжении 24 ч при остаточном давлении 100 мкм. Температура конденсатора "40 С. Начиная с четвертогочаса для идентификации процесса вводят дополнительный подогрев до температуры в камере 31 С. Повьпениетемпературы не должно превышать 4в час. После лиофилизации бумагунарезают в виде дисков диаметром 1 см.Полученные указанным способом диски с холерными агглютинирующими сыворотками используют для постановкиколичественной реакции методом агглютинации.В ряд стерильных пробирок фломбированным пинцетом помещают по одно 30му диску, содержащему по 0,02 млсыворотки соответствующего разведения (1:2, 1:4, 1:8 и т,д.). В пробирки с дисками заливают по 0,5 млстерильного физиологического раство,ра (рН 7,2) таким образом, чтобыЗ 5 они были полностью погружены в жидкость. Пробирки выдерживают 30 мин.в термостате для наиболее полногоэлюирования антител в Физиологический раствор, Таким образом,в элюирую-,щем растворе сыворотки разводят в25 раз (1:50, 1:100, 1:200 и т,д,).Затем во все пробирки вносят по0,5 мл одномиллиардной взвеси смывасуточной агаровой культуры исследуеф 5 мых штаммов (используют два музейныхштамма холерных вибрионов Ч, сЬо 1 егае9 145, серотип "Инаба" и Ч. сЬо 1 егаеУ 1409, серотип "Огава"), т.е, сыворотки разводят еще в 2 раза, полу 50 чая конечные разведения 1:100, 1;200,1:400 и т.д., до титра сывороток,Пробирки встряхивают, ставят на 2 чв термостат при 37 С и затем предва-рительно учитывают реакцию. Оконча 55 тельный учет производят через 18 чвыдерживания пробирок при комнатнойтемпературе по четырехкрестовой системе,1 11292352Изобретение относится к областимедицинской микробиологии и можетбыть использовано для лабораторнойдиагностики холеры.Известен реагент для идентификации вибрионов, состоящий из высушенного бумажного носителя, пропитанного смесью пленкообраэующегостабилизатора и индикатора 13.Однако известный реагент позволяет провести только качественныйанализ и усложняет его проведение,Цель изобретения - упрощение количественного определения холерныхвибрионов,Указанная цель достигается тем,что в реагенте для идентификациивибрионов, состоящем иэ высушенногобумажного носителя, пропитанногосмесью пленкообраэующего стабилизатора и индикатора, в качестве носителя используют хроматографическуюбумагу, которую пропигывают средой,содержащей сахарозу, желатину и индикатор, взятых в соотношении 8-107,1-1,5 Е и 88,5-91 ., при этом в качестве индикатора используют. диагностическую сыворотку "0", "Огава".или "Инаба", или диагностическийхолерный Фаг "С" или "Эль Тор".Реагент приготовляется следующимобразм.Хроматографическую бумагу предва=рительно обрабатывают сахароза-желатинозной средой (8-107 и 1-1,5 Х соответственно). Растворы диагностических сывороток (в физиологическомрастворе рН 7,2-7,4) и Фагов (в защитной сахарозо-желатинозной среде)готовят с учетом получения конечныхразведений при постановке реакцийагглютинации и фаголизиса в титровании. Высушивание систем проводятлиофильно,П р и м е р 1. Для приготовлениясистем диагностических серологических в качестве носителя используютстерильную хроматографическую бумагу 5 х 10 см 2, предварительно обработанную сахарозо-желатинозной средой (10 и 1 й соответственно), вколичестве 1 мл и подсушенную при37+1 С в течение 40 мин. Подготовленные листы бумаги указанного размера пропитывают в кюветах двухкратньпчи разведениями (1:2, 1:4, 1.8,1: 16 и т.д.) специфических холерныхсывороток "0", "Инаба", "Огава" вфизиологическом растворе рН 7,2 вТаблица 1 Способ приготовления Белок, мг/мл, в исходном раз ведении сыворотки (1:100) Срок хранения Специфическая активность сывороток (рабочий титр) дисков Прототип+ До 8 мес 0,6 1:1800 1:3600 Предлагаемый 2 года в разведениях до ра-.бочего титра (срок наблюде.ния) 1,0 Сушка при +80 С приводит к разрушению иммуноглобулина (антитела).Данные приведены при сушке 37 С. 3 1Результаты постановки реакции агглютинации с помощью бумажных, тест- систем серологических и классическим методом идентичны: через 2 ч наступает четкая на 3-4 креста агглютинация Ч 1 Ьг 1 о сЪо 1 егае В 145 с сыворотками "0" и ".Инаба" до их титра, а Ч 1 Ьгдо сЪо 1 егае В 1409 - с сыворотками "Оф и "Огава".Результаты количественного определения антител по белку (методом Лоури) представлены в табл, 1.П р и м е р 2. Для приготовления систем диагностических фаговых стерильную хроматографическую бумагу 5 х 10 см обрабатывают сахарозо-желатинозной средой (10% и 1,5% соответственно) в количестве 1 мл, затем подсушивают в течение 40 мин при 37+1 С. Подготовленные листы бумаги пропитывают холерными диагностичес- . кими монофагами "С" (классическим) и "Эль Тор" в объеме 1,2 мл, используя цельные и десятикратные (10 ", 10 2, 10- до рабочего титра фага) разведения в сахарозо-желатинозной среде (10% и 1,5% соответственно),В две чашки Петри разливают по 18-20 мл питательного щелочного агара рН 7,6. После застывания и подсушивания агара в течение 30 мин при 37+1 С дно чашек расчерчивают на квадраты по количеству используемых разведений диагностических фагов. На каждую из чашек наносят слой 0,6% расплавленного и остуженного 129235 4Через 20 мин листы бумаги покрывают стабилизатором - пленкообразующим полимерным покрытием - 1% поливиниловым спиртом в количестве 0,7 мп и спустя 20 мин помещают в морозильный шкаф при -40 С на сутки. Лиофилизацию проводят на протяжении 24 ч .при остаточном давлении 100-200 мкм.Температура конденсатора -40, начи О ная с четвертого часа для интенсификации процесса вводят дополнительный подогрев до температуры в камере ,31 С. Повышение температуры не должоно превышать 4 в час, После лиофитизации бумагу нарезают в виде дисков диаметром 1 см. Диски с холерными фагами используют при определении фагочувствительности двух музейных штаммов холерных вибрионов (Ч 1 Ьго сЪо 1 егае У 1409 и Ч 1 Ъгдо сЪо 1 егае Р 888).Сравнительная характеристика серо- логических (холерньм "0")диагностических тест-систем в дисках, приготовленных по прототипу и предлагаемому способу приведены в табл. 50 питательного агара рН 7,6 (5 мл),содержащего О, 2 мл взвеси смыва суточной агаровой или двухчасовойбульонной исследуемой культуры. Затем в каждую чашку на поверхность 55 агара помещают диски, содержащиехолерные Фаги "С" (классический) иАктивностьфага (рабочий титр) Срок хранения 0,2 10 О,Я 10 Прототип ф 10 -2 3 мес 10 -3 1,5 года в рабочих разведениях (срок наблюдения) Предлагаемый Сушка при +80 С приводит к гибели фаговых частиц.Данные приведены при сушке 37 С. при комнатной температуре в течение 30 мин чашки инкубируют в термостате при 37+1 С,Предварительный учет результатов реакции проводят через 4 ч, окончательный через 18 ч. Наличие ореола лизиса вокруг диска при четком выявлении газона культуры на чашке оценивают как положительный реэуль" тат. Четкий лиэис Ч. сЬо 1 егае У 888 наблюдают через 4 ч иикубирования в термостате, а лизис Ч. сЬо 1 егае Среда для сохранения и выхода специфических антител и корпускул фагов подобрана в опытах с применением различных конЦентраций еахарозы и желатина, растворенных в дистиллированной ВодеВ 1409 через 18 ч. Результаты идентичны результатам при постановке реакции классическим методом и с помощью систем диагностических фаго вых, Количество живых фаговых частицв дисках проверяют методом Грациа (табл. 2).Сравнительная характеристика фаговых холерных "Зль Тор" диагности ческнх тест-систем в дисках, приготовленных по прототипу и предлагаемому способу приведены в табл. 2. Количествокорпускул фага, выявляемых методомГрациа (изразведения10 ) Оптимальные результаты по всемиспользованным диагностическим препаратам получены со средой, содержа щей 8-.103 сахарозыи 1,0-1,5 Х желатина.В табл. 3 приведены средние данныеиз 10 опытов достигаемого эффекта по отношению к прототипу.О О Ф 0 с О 1 Э 1 Р, Э 1 С Х О О 1 с ЭЯ с О Ф с 0 лл сч сч И л ИЪ л сч1Д1О Х О О д О Р1 О 10 О О О И О 11 сОФ 1 Х 5 йН3 ОООФО 1: Н 1:;Е 1Э 1 Р, Ф ФЕО Ф О И;й Ю О о О И о 1 О Р 1" Х Х О ОН 63 Е О Х О Х ,О О Р О И О ф 0 О Х ф Х 1 С Ф Я Х Й О 1 Н о К О 4 1 с 3 1 3 Э О Ф Р 1 Р О О ф 1 ХО1Х ОХлО ОИа а а а л л л л м -сч сч м . сО О О О О О О О О О О О О О О С О О О О О О О О сч м л ф фсчл ф ф л Ю с 1 л л л л л сч -О л ОСЧ ф Э 0 сч сч л лл л л л л л О О О - - О О О - -О Э ;Х Х ЭХХ Э ЭХ МХй РО ф НХ ХО Н ФРИИ Ю ХОЭ . Э ХХ ХХ ХХ Х ЮС 0 О Тс 1с 1 с9 129235 10Предварительная пропитка хроматог- постановке реакций агглютинации и фарафической бумаги сахарозо-желатиноз- голизиса. Лиофильное высушивание и ной средой обеспечивает наиболее предварительная пропитка сахарозополныйвыход из диска специфических желатинозной средой предотвращает антител и фаговых корпускул. 5 гибель антител и фаговых корпускули позволяет сохранять эти системыРазличное содеМаие в системах в течение 1 5 лет для фагов (срокм,Эантител и фаговьоасиц позволяет наблюдения) и 2 лет для сывороток проводить количественный анализ при (срок наблюдения).Составитель П.БонарцевРедактор О.Колесникова Техред С,Мигунова Корректор Л.ПилипенкоЗаказ 9304/20 Тираж 521 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб д, 4/5 Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4