Способ твердофазного культивирования мицелиальных грибов

ИВИ- ущность иомассыртипев р 1 21) 4841 529/1 322) 19.06.90"46) 30.12.93 Бюл. Иа 48 - 4771) Воронежский технологический институт72) Антипова Л.В.4) СПОСОБ ТВЕРДОФАЗНОГО КУЛЬ9 ВАНИЯ МИЦЕЛИАЛЬНЫХ ГРИБОВ57) Использование: биотехнология, Сзобретения; с целью повышения выходаупрощения способа грибы КЬюров ру- 8 и Ищоров отупериодическогосодержащей пае- 22 ч до достобщей продолжитПредлагаемыйсевной материалход биомассыуровне биохимичегрибов по сравн га 1 1362 -284 выращивают путем наслаивания питательной среды, яичные отруби, через каждые 20 ижения высоты слоя 7 - 8 см приепьности процесса 120 - 124 ч способ позволяет сэкономить ло-, в 4 - 5 раз, а также увеличить вы - 30 раза при одинаковом ской активности мицелиальных нию с известным способом, 2 табл.Изобретение относится к биотехнологии и может найти применение при получении целевых ферментов в процессе выращивания на твердой питательной среде.Известны способы поверхностного выращивания микромицетов на твердой питательной среде, включающей пшеничные отруби с добавлением добавок - индукторов .биосинтеза и добавок-рыхлителей для повышения выхода целевых продуктов Ц.Недостатком этого способа является невозможность. значительно увеличить выход ферментов из-эа ограниченности высоты, питательного слоя, затрудняющего аэрирование культур.Наиболее близким по технической сущности к изобретению является кюветный способ твердофазного культивирования мис целиальных грибов, вкдючающий стерили.зацию увлажненных до 58-68 пшеничных отрубей (возможно добавление 5-20до-, бавок-рыхлителей), инокулирование посевным материалом с содержанием спор не менее О;7 млрд. в 1 г, тщательное перемеши-. вание. компонентов, раскладывание в кюве.- ты высотой слоя 2-2,5 см и выращивание культур в течение 32-48 ч (в зависимости от индивидуальных особенностей микроорга. низма) при температуре 30-35 ОС (в зависимости от термофильности культуры), при периодической продувке стерильным воздухом с целью аэрирования, уборку камеры, обработку ее формалином, аммиаком, паром 2).Основным недостатком такого способа является недостаточно высокий выход продукта.Целью изобретения является повышение выхода биомассы,Это достигается тем, что в способе, предусматривающем стерилизацию увлажненных пшеничных отрубей, инокуляцию их посевным материалом, перемешивание, раскладывание полученной смеси в кюветы и выращивание, в качестве посевного материала используют грибы рода ЯЫгорцэ, а в процессе выращивания периодически. через каждые 20-22 ч наслаивают свежие увлажненные пшеничные отруби толщиной в 1,5- 2,0 см до достижения конечной толщины слоев 7-8 см и процесс выращивания ведут в течение 120-124 ч.Способ заключается в следующем.Кюветы для поверхностного выращивания микроорганизмов размером 40 х 75 см с высотой бортов 12 см и отверстиями для аэрирования культуры моют, обрабатывают формалином, аммиаком и паром. Пшеничные отруби увлажняют до 58-65 3, стерилиэуют в течение 1-1,5 ч при 0,15 МПа, охлаждают и при температуре 40-45 С вносят посевной материал (например, культурымикромицетов ВЫкороз руцщавез р 1-е иЯЫхорцз огугае 1384-262 на пшеничных отрубях с содержанием спор не менее 0,7млрд. на 1 г) в количестве 1-2 к обьемупитательной среды. Смесь тщательно и быстро перемешивают, при этом конечная10 температура смеси должна быть 30-32 С.Полученную смесь раскладывают в кюветыслоем 2-2,5 см, При использовании болеетонкого слоя происходит быстрое подсыхание твердофазной питательной среды,.а при15 толщине слоя более 2:,5 см наблюдаютсянедостаточно равйомерное . прорастаниеспор в процессе роста, снижение аэрациикультуры.Проращивание культуры ведут при тем 20 пературе 30-32 ОС (наиболее характерныеусловия для микромицетов) в течение 20-22ч, Время проращивания 20-22 ч характеризуется особым физиологическим состоянием культуры. К этому времени она находится25 в экспоненциальной фазе развития, которая:характеризуется высокой скоростью размйожения и началом формирования комплекса экзогенных ферментов, которыеявляются целевыми продуктами. Время ме 30 нее 20 ч недостаточно для вызревания, достижения наибольшей скорости. размножения и развития продуцентов,Время выращивания более 22 ч приводит к резкому снижению скорости размно 35 жения клеток на фоне роста ихбиохимической активности,Через 20-22 ч проращивания на твердую поверхность среды наслаивают новыйпитательный слой - отстерилизованные ув 40 лажненные пшеничные отруби высотой 1,52,0 см, поддерживая температурукультивирования постоянной (30-32 С).Операцию аналогично повторяют несколькораз до достижения общей высоты питатель 45 ного слоя 7-8 см. Использование высотыпитательного слоя менее 7-8 см не вполнеотвечает поставленной цели из-за экономических соображений, а высота слоя более7-8 см нежелательна в связи с превалирова 50 нием старения культуры, снижением ееаэрации, значительным накоплением продуктов биохимической деятельности продуцентов.Рекомендуемая общая продолжитель 55 ность выращивания 120-124 ч установленаэкспериментально и связана также с изменением физиологической активности культуры и снижением воэможности к аэрации,При меньшей продолжие;,цест;1 выращивания при испОЛЬЗОвв л:л "1 вл 1 я не 1839183П р и м е р 2, 1 кг пшеничных отрубейсреднего помола, крахмалистостью 18увлажняют водопроводной водой до конечной влажности 63, стерилиэуют в автоклаве при 0,15 МПа в течение 1 ч. Отстерилизованные отруби охлаждают и вносят посевной материал. Смесь тщательно перемешиваюти раскладывают в кюветы высотой слоя 2,5см. Накрывают крышкой и ведут выращивание 20 ч. Затем новый питательный слой 1,5 45см наслаивают на проросшую культуру,Операцию повторяют через 40, 60, 80 ч(при,общей продолжительности культивирова ния 120 ч. Затем культуру извлекают, опре- "деляют качество биомассы и используют по 50назначению, Кюветы обрабатывают,П р име р 3, Пшеничные отруби предварительно готовят аналогично примерам 1,2, раскладывают в кюветы высотой слоя 3,0см. Накрывают крышкой и ведут выращивание в течение 20 ч. Операцию повторяютчерез 40, 60, 80 ч от начала выращивания,наслаивая сверху пшеничные отруби высо той 1,5 см, По истечении общего временивыращивания 120 ч культуру сниМают, опревозможно достичь нужной высоты слоя, а ;следовательно, значительно повысить выход продукта с единицы рабочей поверхности, При этом культура не имеет нужного уровня активности ферментов. Время выра,щивания более 124 ч нецелесообразно всвязи со старением культуры и снижениемвыхода активной биомассы.П р и м е р 1. 1 кг пшеничных отрубей среднего помола с крахмалистостью 18увлажняют водопроводной водой до конечной влажности 63, стерилизуют в автокла, ве при 0,15 МПа в течение 1 ч.Подготовленные отруби охлаждают до 40- ,45 С, инокулируют посевным материаломмицелиальных грибов ВЫгорцз (2 к массе увлажненных отрубей с содержанием спор 0,7 млрд на 1 г), тщательно перемешивают и раскладывают .в кюветы (размером 20 х 40 х 12 см) высотой 2 см. Накрывают крышкой и ведут выращивание в течение 20 ч при 30 С. Затем наслаивают на проросшую в питательной среде новую партию аналогично подготовленных отрубей высотой 1,5 см, поддерживая температуру постоянной (30 С). Операцию повторяют через 40, 60 и 80 ч от начала выращивания. Культивирование продолжают до достижения общей продолжительности 120 ч, затемповерхностную культуру на пшеничных отру, бях извлекают из кюветы и определяют качество биомассы по уровню глюкоамилазной (ГлА) и протеолитической (ПА) активности, а кювету обрабатывают. 10 15 20 25 30 деляют качество биомассы и используют, а кюветы обрабатывают.П р и м е р 4. Пшеничные отруби (по примерам 1, 2) раскладывают в кюветы высотой слоя 2,2 см. Проращивание ведут в течение 21 ч, а затем операцию повторяютчерез 42, 63, 84 ч от начала выращивания,выдерживая каждый раз высоту слоя 1.3 см.По истечении 124 ч от начала процесса культуру снимают, определяют качество биомассы и используют.П р и м е р 5. Инокулированные пшеничные отруби(по примерам 1, 2) раскладывают в кюветы высотой слоя 2 см и проращивают в течение 22 ч, Операцию повторяют через 44, 66 и 88 ч при высоте каждого слоя 1,5 см и после последнего наслаивания ведут доращивание до общей продолжительности 128 ч, затем поверхностную культуру извлекают из кюветы, определяют активность биомассы и используют.П р и м е р 6. Инокулированные пшеничные отруби (по примерам 1, 2) раскладывают в кюветы высотой слоя 2 см и проращивают в течение 22 ч. Операцию повторяют через 44, 66 и 88 ч при высоте каждого слоя 1 см. Затем культуру доращивают до общей продолжительнбсти процесса 124 ч. Далее поступают, как в вышеприееденных примерах,Зкснереентальные данные.по примерам 1 - 6 приведены в табл, 1. Опытные данные приведены для ВЫюроэ руовацеэ р-в - продуцента глюкоамилаэы и протеолитических ферментов, Аналогичная зависимость, отмечена и для ВЫоров огугае 1362-284.Предлагаемое техническое решение имеет следующие преимущества по сравнению с прототипом:снижение трудоемкости эа счет снятия операций по обработке кювет, подготовке посевного материала и ручного труда по раскладыванию инокулированной питательной среды. Для получения одного и того же количества культуры по прототипу при рекомендуемой высоте слоя 2-2,5 см производственный цикл необходимо повторить 3- 4 раза со всеми операциями по подготовке кювет, помещений, посевного материала, основного выращивания;экономия посевного материала в 4-5 раза, так как для осуществления способа по прототипу каждый производственный цикл потребует расход посевного материала 1-2кмассе увлажненных отрубей, по предлагаемому техническому решению посевной материал используется один раэ лишь на первой стадии;увеличение выхода готового продукта (поверхностной культуры) в 2,5-3,0 рдэа с1839183 Таблица 1 10 единицы растильной площади при практически одинаковом уровне биохимическойактивности мицелиальных грибов. Общая сравнительная характеристика обоих способов представлена втабл. 2.4(56) Жеребцов Н. АЩеблыкина Л. В. Культивирование плесневого гриба ВЫорцз ру 9 еацев р-е на твердых питательных средах. Микробиологическая промышленность, - 1972, вып. 2, с. 31.Грачева И. М. Технология ферментных препаратов. М,; ВО "Агропромиздат", 1987.1839183 10 Таблица 2 Значение показателей Показатели по предлагаемомутехническому ревепо прототипу нию Обработка формалиОбработка формалином, аммиаком, па 0,15 МПа в течение 1 ч, ЧЧ 58-68Гл А ПС с целью .повышения выхода биомассы, в качестве посевного материала используют грибы рода ЯЬаорцз, в процессе выращивания периодически через каждые 20 - 22 ч наслаивают свежие увлажненные пшеничные отруби толщиной е 1,5 - 2 см до достижения конечной толщины слоев 7 - В см и процесс выращивания ведут в течение 120 - 124 ч. Формула изобретения. Составитель Л,Антипова Техред М.Моргентал Корректор Л.Ливринц редактор Л.Павлова Заказ 3403 Тираж Подписное НПО "Поиск" Роспатента113035, Москва, Ж, Рауаская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101 1, Перечень технологических операций процесса для получения. аналогичного количества поверхностной культуры: подготовка кювет, стерилизация и увлажнение отрубей2. Инокулирование посевным материалом 3. Выращивание, ч 4; Съем культуры е 5. Обработка, мойка кювет 6; Стерилизация и увлажнение отрубей7. Инокулирование посевным материалом8. Выращивание, ч9. Далее процессы повторяется 3 раза,10. Высота слоя, см11; Выход продукта (поверхностной культуры с единицы растильной площади, кг/см12. Биохимическая активность, ед/г: С ПОСОБ ТВЕРДОФАЗНОГО КУЛЬТИИРОВАНИЯ МИЦЕЛИАЛЬНЫХ ГРИБОВ, редусматривающий стерилизацию увлаженных пшеничных отрубей,:.,инокуляцйю х посевным материалбм, перемевивание, аскладывание полученной смеси в кюве. ы и выращивание, отличающийся тЕМ; что,ном, аммиаком, паромб,5 МПа в течение 1 ч,Ф.58-68 1-2 к массе отрубей 36-42