Способ изолирования жизнеспособных зародышевых мешков у растений

ООЗ СОВЕТСкихОЦИАЛИСТИЧЕСКИЕСПУБЛИК 822665 А ГОСУДАРСТВЕНОЕ ПАТЕНТНОВЕДОМСТВО СССР(54) СПОСОБ СПОСОБНЫХ У РАСТЕНИЙ (57) Испольэо вирование тка лекционно-ге Сущность из зародышевые иэотоническо вальными игл ЗОЛИРОВАНИЯ ЖИЗНЕАРОДЫШЕВЫХ МЕШКОВ вание: биотехнология ней растений, цитоло нетические исслед обретения: жиэнеспо мешки растений изол м растворе микроп ами под микроскопом культигия, сеования. собные ируют в репаро табл,веннпетум тсутствием инт ментального т(56) Сидорова Н,В. Особенности ультраструктуры изолированных зародышевыхмешков табака //Докл. АН УССР, 1985, сер.Б, ЛЬ 12, с. 63-66,ЕЬоц С., Уапц Н.У.//Р 1 апта, 1985, ч. 165,р. 225-231.Ни ЗЫ-у ет э 1.//Аста Во 1 апса 9 пса,1985, ч 27, й. 4, р.337-344.МЧадпег Ч.Т. е 1 а 1.//Рапт Зсепсе, 1989,ч, 59, р. 127-132. Изобретение относится к растениеводству и биотехнологии сельскохозяйственных растениК, в частности к использованию метода культуры органов, тканей и клеток растений и ч 1 го в целях улучшения исходного материала для селекции, и может быть использовано для разработки методов ускоренного получения гомоэиготных линий и преодоления стерильности отдаленно родственных гибридов, для генной инженерии растений на генном и геномном уровне, а также в физиологии и генетике растений для изучения роли ядра и цитоплаэмы в мегагэметах, явлений оплодотворения, эмбрио- и эндоспермогенезэ в контролируемых условиях, механизма активации мегэгамет,Цель изобретения - упрощение осуществления способа при удешевлении, сокращении трудоемкости операций и увеличении выхода жизнеспособных зародышевых мешков у растений преимущест 51)5 А 0167/00, А 01 Н 1/04, 4/О Поставленная цель достигается тем, что способ изолирования жизнеспособных зародышевых мешков у растений, включает вычленение семяпочки иэ завязи, изолирование зародышевого мешка из семяпочки, контроль жизнеспособности зародышевого мешка, причем, изолирование зародышевых мешков производят в изотоническом растворе микропрепаровальными иглами под микроскопом,Используемые в заявленном способе признаки в автономном друг от друга применении были известны для решения и достижения иных, чем в заявленном способе задач и целей, но в совокупности не применялись. Эффект совокупного их использования не мог быть достигнут при автономном использовании любого из означенной совокупности признаков. Достижение цели изо 182268555 бретения возможно только при использовании всей совокупности признаков и в указанной последовательности их применения, Новые свойства. эффект от совокупного использования означенных в заявленном способе признаков не был очевиден и не мог быть логическим путем выведен, Напротив, логическим путем можно сделать лишь один вывод, а именно, о невозможности и практической неосуществимости вычленения жизнеспособных зародышевых мешков беэ предварительного культивирования семяпочек в мацерирующей среде, и тем более этого невозможно достичь. в соответствии с устоявшимся мнением, с использованием техники вычленения с помощью микропрепаровальных игл, при которой фиксация в ацетоалкоголе или других аналогичных фиксаторах, окраска невитальными красителями и предварительная мацерация представлялись обязательными. Этот устойчивый стереотип, подкрепленный мировым опытом работы с вычислением зародышевых мешков покрытосеменных для каких бы то ни было задач, не позволял логическим путем прийти к заключению о возможности решения означенной в формуле изобретения цели предлагаемым в заявке способом (совокупности признаков). В силу всего вышеизложенного. предлагаемое техническое решение неочевидно, обладает новизной и существенными отличиями, В заявленном способе упрощение осуществления способа изолирования жизнеспособных зародышевых мешков достигается тем, что полностью исключается операция культивирования семяпочек в мацерирующей среде сложного состава непосредственно перед вычленением и осуществление операции изолирования проводится при помощи микропрепаровальных игл, в связи с чем отпадает необходимость проведения трудоемкой операции подбора концентраций и состава мацерирующих агентов, режимов культивирования, специфичных для каждого вида растений, а также необходимость использования операций центрифугирования или фильтрации через нейлоновые фильтры с определенным диаметром пор, Кроме того, исключением операции культивирования в мацерирующей среде и использованием микропрепаровальных игл для изолирования жизнеспособных зародышевых мешков достигается и удешевление способа, так как отпадает необходимость расхода таких дорогостоящих веществ как мацерирующие ферменты и оборудования в виде центрифуги или нейлоновых фильтров, Изолирование зародышевых мешков по за 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 явленному способу осуществляют в изотоническом растворе, который может быть любым и универсален для всех видов растений, так как внутреннее давление в цитоплаэме клеток всех растений практически одинаковое. Состав изотонического раствора может быть предельно простым и состоять из раствора одной неорганической соли, например, или какого-либо осмотика типа полиэтиленгеликоля, например, Изотонический раствор может быть представлен составом среды для последующего культивирования зародышевого мешка, если ставится такого рода задача. Единственная требованиями, предьявляемыми к изотоническому раствору, является относительное соответствие плотности данного раствора осмотическому давлению в растительной клетке и отсутствие в его составе сильных токсических веществ, Относительное соответствие плотности изотонического раствора осмотическому давлению внутри клеток может быть элементарно проконтролировано при помещении клеток или зародышевого мешка в такой раствор. Раствор считается изотоническим, если при помещении растительных клеток или зародышевого мешка в него не имеют место плазмолиэ или разрыв клеточных стенок. Повышение выхода жизнеспособных зародышевых мешков достигается тем, что в заявленном способе эа счет вычленения при помощи микропрепаровальных игл в иэотоническом растворе исключаются неизбежные потери, которые происходят при центрифугировании, или при фильтрации через нейлоновые фильтры, или при отборе проб для контроля степени изолированности зародышевых мешков от соматических клеток, или при медленном раздавливании мацерированных завязей. Кроме того, так как при культивировании в мацерирующем растворе (по прототипу) процесс мацерации идет неравномерно и на момент окончания операции с неизбежностью часть семяпочек окажется недомацерированной, т.е. зародышевые мешки еще не будут изолированными, а часть зародышевых мешков окажется промацерированной до стадии протопластов клеток, неизбежны потери и такого характера, в то время как при осуществлении по заявленному способу с изолированием жизнеспособных зародышевых мешков при помощи микропрепаровальных игл в иэотоническом растворе воэможность этих потерь исключается.Единственным ограничением применимости заявленного способа, вероятно. является трудность осуществимости его у видов растений, обладающих интегументальным1 О 15 20 25 30 Э 5 40 45 50 55 тапетумом (эндотелием, или эпителием), Интегументальный тапетум - это один, как правило, слой покрытых кутикулой таблитчатых клеток, наполненных густым содер-,жанием и крупными ядрами, число которых иногда увеличивается до двух в каждой клетке, он образуется из внутреннего слоя клеток покрова и примыкает непосредственно к зародышевому мешку и, вероятно, выполняет питающую по отношению к зародышевому мешку функцию. Он встречается преимущественно у видов спайнолепестных растений с одним покровом семяпочки и у прочих растений имеет место редко. Данное ограничение применимости способа не является абсолютным. Во-первых, среди видов, имеющих семяпочки с интегументальным тапетумом могут быть обнаружены те, у которых способ будет осуществляться. Во-первых, в растворе повышенной вязкости клетки интегументального тапетума, вероятно, можно будет отделить от зародышевого мешка. В-третьих, для целого ряда задач по культивированию зародышевого мешка (при надлежащем контроле за тем, какие именно клетки индуцируются к развитию при индивидуальном культивировании зародышевого мешка) с наличием интегументального тэпетума вполне можно не считаться, а просто выбраковывать те зародышевые мешки, у которых к развитию индуцированы клетки интегументального тапетума, К тому же вероятность индукции к развитию клеток интегументального тапетума чрезвычайно мала в силу крайней специализации его клеток как питающих (фактически специализировавшихся с потерей тотипотентности, по крайней мере на стадии зрелого зародышевого мешка, т.е. нэ той стадии, на которой производится изолирование жизнеспособносхи зародышевых мешков для культивирования). В этом случае будут затруднены только манипуляции с клетками и ядрами зародышевого мешка и наблюдения за ходом активации их к развитию, т.е. будет затруднено решение ряда специфических задач, которыми, однако, далеко не ограничивается круг возможных задач, связанных с культивированием зародышевых мешков.Способ осуществляют следующим образом.Берут завязи с семяпочками у растений преимущественно без интегументального тапетума, вычленяют семяпочки из завязей макропрепароаальными иглами и помещают, например, в лунку на предметном стек- ле в изотонический раствор. состав которого выбирают в зависимости от решаемых при помощи заявленного способа эадач (им может быть среда для последующего культивирования, любая неорганическая соль, любой осмотик и т.п., не токсичный по отношению к растительной клетке), а изотоничность проверяют предварительным помещением, например, в изотонический состав растительных клеток или жизнеспособных зародышевых мешков (состав считается изотоническим. если при помещении в него растительных клеток или жизнеспособных зародышевых мешков они не плазмолиэируют и не нарушается их целостность посредством разрыва клеточных стенок), при необходимости, диктуемой исключительно, например, задачами, решаемыми при помощи заявленного способа, семяпочки подкрашиваются витальными красителями (операция необязательная), семяпочку в иэотоническом растворе помещают в поле зрения микроскопа, изолирование зародышевых мешков осуществляют микропрепаровальными иглами при приемлемом увеличении микроскопа, осуществляют, при необходимости контроль жизнеспособности клеток зародышевого мешка, например, с помощью витальных красителей (операция необязатальна).П р и м е р 1. Экспериментальное доказательство осуществимости способа проводили на материале проса посевного (Рэпсов еИасеоп 1 ). Прототип для данного вида неосуществим в силу того. что концентрация мацерирующих агентов и режимы мацерации в прототипе подобраны для кукурузы, а не для проса посевного. Кроме того, зародышевые мешки проса посевного несравнимо меньше по размерам, поэтому невозможно использовать и нейлоновые фильтры применяемых в прототипе диаметров пор, В силу меньших размеров зародышевых мешков проса посевного проблематичным становится вообще использование нейлоновых фильтров для изоляции зародышевых мешков проса посевного. Семяпочки из завязей вычленяли при помощи макропрепаровальных игл. Семяпочки помещали в лунку на предметном стекле в каплю среды для культивирования сложного состава, изотоничность которой проверяли предварительно помещением в нее клеток суспензионной культуры проса посевного. При этом клетки суспензионной культуры не претерпевали плаэмолиза и сохраняли целостность, т.е. подтверждали изотоничность раствора, Микропрепаровальными иглами в изотоническом растворе под микроскопом МБСпри увеличении х 29 вычленяли зародышевые мешки при средней производительности около 20 зародышевых мешков эа 1 час. При этом потери за счет10 20 травмирования зародышевых мешков в заявленном способе в отличие от прототипа не имели места. Так как семяпочки в заявленном способе не помещались предварительно в мацерирующий раствор, не подвергались фильтрации через нейлоновые фильтры (как по прототипу), поэтому и не было из потерь, связанных с осуществлением и этих операций, Тем самым увеличивался выход зародышевых мешков и упрощалось осуществление способа. Так как не использовались дорогостоящие мацерирующие агенты, нейлоновые фильтры определенного диаметра пор, центрифуга, удешевлялось осуществление способа. Исключены такие трудоемкие операции, как подбор режимов культивирования и концентраций мацерирующих агентов, операция культивирования в контролируемых условиях, операции центрифугирования или фильтрации суспенэии клеток семяпочек, тем самым достигнуто сокращение тоудоемких операций. При окраске витальным красителем ечапв Ь ое выделенные зародышевые мешки окрашивались синим цветом, что подтверждает сохранение их жизнеспособности после осуществления способа,П р и м е р 2. Экспериментальное доказательство осуществимости способа проводили на материале сорго трех видов, одного вида пшеницы, подсолнечника, зверобоя пронэеннолистного, каланхое, томатов в соответствии с описанием способа, данным в примере 1.Результаты испытания приведены в таблице,Таким образом, заявленный способ осуществим в рамках-заявленных притязаний у разных видов растений с отсутствием интегументального тапетума. Изолирование зародышевых мешков по заявленному 25 30 35 40 способу возможно с высокой производительностью, что показано в примере 1 на просе посевном При осуществлении заявленного способа не имеют места потери, связанные с проведением операций по изолированию зародышевых мешков, в то время как при осуществлении способа по прототипу, когда он осуществим, они оказываются неизбежными. При этом осуществимость способа по прототипу для данных видов, использованных в примерах, оказывается невозможной. При осуществлении по заявленному способу исключаются трудоемкие операции мацерации (с неизбежных . подбором концентрациЯ мацерирующих агентов и режимов мацерации) и изолирования фильтрованием через неЯлоновые фильтры с порами определенного диаметра. Осуществление по заявленному способу удешевляется эа счет неиспользования гаких дорогостоящих веществ как мацерирующие агенты, а также эа счет исключения использования микрошейкеров и нейлоновых фильтров. Тем самым доказывается осуществимость способа с упрощением его осуществления при удешевлении, сокращении трудоемкости операций, а также увеличении выхода жизнеспособных зародышевых мешков. Формула изобретения Способ изолирования жизнеспособных зародышевых мешков у растений, включающий вычленение семяпочки из завязи, изолирование зародышевого мешка иэ семяпочки и контроль его жизнеспособности, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения и удешевления способа, изолирование зародышевого мешка производят в изотоническом растворе микропрепаровальными иглами под микроскопом непосредственно после вычленения.10 1822665 Наличие ин- Возможность осуществле- Витальность Вид растения зароды шевв тегументаль ния ного петума эаявл. способ бу Да Нет Нет Нет Нет Да Нет Да Нет Нет Да Да Нет Нет Нет Нет Нет Нурег сца реИога 1 цгпусорегзсоп езсц 1 еп 1 це Да Да Нет Да Да Нет Нет Ка 1 апсйое зр,СоставительТехред М,Моргентал Редактор Корректор М.Керецман Заказ 2163 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Рэушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 г 1 Мсца аезт 1 чцвЯогц 1 тцгп зцдапепзе3. зцЬо 1 аЬгезсепзЯ. зассйагатцтНеИаптцз аппццз Да Да Нет Да Да Да ых мешков прототиппо заявленному спосо