Способ определения малонового диальдегида в крови

(51)5 6 0 И СА Т АВТОРСКОМ ВИДЕТЕ У ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОВЕДОМСТВО СССР(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МАЛОНОВОГО ДИАЛЬДЕГИДА В КРОВИ(57) Использование: медицина, способы определения в биологических системах малонового диальдегида (МДА). Цельизобретения - повышение информативности способа за счет возможности одновременного анализа интенсивности процессовперекисного окисления липидов в плазме иэритроцитов, а также характеристики состоИзобретение относится к технике определения в биологических системах малонового диальдегида (МДА) для характеристики происходящих в них процессов перекисного . окисления липидов, что может быть использовано в различных областях экспериментальной и клинической медицины, а также биологии.Целью изобретения является устранение существующих недостатков - повышение информационной значимости способа за счет возможности одновременного и раздельного анализа МДА в плазме и эритроцитах, а также определения в них антиоксидантной активности, что в конечном итоге позволит более адекватно оценивать состояние процессов ПОЛ в исследуемых биологических системах,яния антиоксидантнои активности, Сущность изобретения; определяют МДА раздельно в двух образцах одного объекта, причем в одном из них - после инкубации образца с ингибитором свободнорадиальных реакций, например. ЭДТА-МДА, а в другом при активации перекисного окисления, например, ионами двухвалентного железа - МДА, рассчитывают МДА-З, как (МДА) - (МДА) эндоген ного активатора перекисного окисления липидов МДА/МДАи интегрального индекса интенсивности перекисного окисления липидов, а представляющего собой (МДА) (МДА) (МДА)МДА-З), по которому судят либо о возрастании, либо об уменьшении перекисного окисления липидов в биологической системе, 1 табл,Ъф ОПоставленная цель достигается за счет4 того, что содержание МДА определяют в Ь двух параллельных образцах, получаемых, ф из одного объекта. При этом процесс подго- С) товки к исследованию одного из параллельных образцов осуществляют в присутствии ингибитора свободнорадикальных реакций (антиоксиданта) - этилендиаминтетрауксус-, ной кислоты (ЭДТА), являющейся комплексоном и связывающей ионы железа, всегда присутствующих в ничтожных количествах в биологических системах и индуцирующих ПОЛ. Кроме того, этот реагент является антикоагулянтом и предотвращает ее свертывание, Конечная концентрация ЭДТА в образце составляет 0,5-1,5 70, Более низкие концентрации реагента могут оказаться недостаточными для полного связывания эндогенных ионов двухвалентного железа,инциирующих ПОЛ, а использование более антиоксидантные возможности, Таким обвысоких концентраций препарата является разом, антиоксидантная активность биолоизбыточным и не ведет к улучшению резуль- гической системы оценивается по величинетатов. образовавшегося МДАпри индукции ПОЛДругой параллельный образец готовят в 5 стандартным зкзогенным активатором своотсутствии антиоксиданта и перед выполне- боднорадикальных реакций, Увеличениением реакции МДА с ТБК проводят инкуба- МДАв сравниваемой однотипной биолоцию образца с активатором гической системе следует расценить каксвободнорадикальных реакций (проокси- снижение антиоксидатных свойств этой сидантом) - стандартным количеотвом ионов 10 стемы, что является фактором, способствудвухвалентного железа (конечная концент- ющим возрастанию свободнорадикальныхрация реагента - 0,06%). Время инкубации процессов, Уменьшение МДАв этих услоподбирают экспериментальным путем, что- виях будет свидетельствовать о возрастабц оно было достаточным для прохождения, нии антиоксидантной емкостиреакции. индукции ПОЛ. При работе с образ биологической системы, что препятствуетцэми крови наиболее подходящим време- распространению ПОЛ, Так как зависинем инкубации является 30 - 45 мин, Оба масть между выявленным количествомпараллельных обрчазца в каждом очереДНом МДА-З.и антиоксидантной активностью сиисследовании всегда инкубируют в одних истемы является обратной, то показатель антехжеусловияхвтечеийевыбранногостан-:20 тиоксидатной активности целесообразнодартного времени-. выражать в условных единицах - как велиПо окончании.инкубации парчаллельгные . Чину концентрации МДАс отрицательнымобразцы готовят для выполнения реакциис знаком, что удобно при графическом изоТБК и определяют в каждом из них конличе- бражении динаМики этого параметра.ство МДА. МДА, выявленный в параллель При определении МДА в крови (разном образце, содержащем ингибитордельно в плазме и эритроцитах)способ высвободнорадикальных реакций (ЭДТА), полняется следующим образом.обозначают как МДА, а содержащем про-Кровь на исследование забирают в 2оксидант (ионы двухвалентного железа) - . пробирки;1-япрЬбиркасодержит 0,1 млфикак МДА; Разнйцу между МДАф и МДА30 зиологического раствора в 10 ед гепарина в. обозначают как МДА. " . качестве антикоагулянта; 2-я пробирка - 0,1МДА- пул МДА, образованный в бйо-мл 5 7 й ЭДТА на физиологическом растворе,.логической системе в жйвом организме на В обе пробирки помещают по 1,0 мл кровимомент получения образца (забора крови); (тотчас после ее получения), смесь тщательвследствие протекающей в ней процессов З 5 но перемешивают, не допуская образоваперекисногоокислениялипидов, Целесооб- .; НЙя сгустков. Йа.всех этапах подготовкиразно считать, что пул МДАхарактеризует образцов не допускается попадание следоийтенсивность процессов ПОЛ вданной би-вцх количеств ЭДТА в пробирку с кровью,ологИческой Сйстеме, В связи с этим возра-содержащей гейарин,стание МДАрасценивается как активация 40 Кровь центрифугируют 10 мин при 3000ПОЛ, а снижение данного показателя - как об/мин; плазму отделяют от зритроцитов,уменьшение процесса лйпопероксидации.зритроцитарную массу однократно промыМДА- сумма пулов МДАи МДАйают в 5 мл физиологического раствора и(см, ниже). Является промежуточным пока-центрифугируют .10 мин при 2000 об/мин.зателем И используется для расчета МДА-З, 45 Посглеосаждения эритроцитов физиологиМДА- пул МДА, образованный.в био-Ческий раствор удаляют с 10-15 % поверхлогической системе при индукции пОл . ностно расположенных эритроцитов,стандартным экзогениым активатором сво- Отмытые эритроциты гемолизируют дистилбоднорадикальнцх реакций. Характеризует, . лированной водой в отношении 1: 5 (0,2 млсостояйие антиоксидантной системы (анти седимента эритроцитов + 1,0 мл дистиллиоксидантную емкость) и ее способностьрованнойводы).ИНаКтИВИРОВатЬ ПОЛ, ЕСЛИ РЯД РаЗЛИЧНЫХ ДЛЯ ИССЛЕДОВаНИЯ МДАГОтОвят ОбраэобразЦов подвергнуть воздействию стан- . цы плазмы и эритроцитов, которые были вдартного Экзогейнбго активатора парекис-контактег с ЭДТА: 1-ю пробирку помещаютного окисления липидов, то минимальное 55 0,4 Мл плазмы, а во 2-ю - 0,4 мл гемолизатаколичество МДА образуется в том образце, эритроцитов. В каждую пробирку добавлякоторый располагает наиболее мощной ан- ют 0,1 мл 5 ф ЭДТА(конечная концентрациятиоксидантной системой, Напротив, макси- - 1 Щ Образцы перемешивают и оставляютмальное количество МДАбудет в наЗОминпри 37 С(илитермостатированиебиологической системе, имеющей низкие10 15 20 25 30 35 40 45 50 6,опЕ,80 13 1,58 10 0,4 где А - содержание МДА в мкмоль/л) или нмоль/мл) в плазме; 10 - коэффициент для пересчета концентрации исследуемого вещества в мкмоль/л; 5 - конечный объем реакционной смеси (мл); 0,4 - объем плазмы, взятый на анализ (мл); 1,56 10 - коэффициент молярной экстинкции ТБК-комплекса (моль см л); Еоп - оптическая плотность исследуемого раствора по показанию спектрофотометра; 80,13 - пересчетный коэффициент. 55 проводят при постоянном легком покачивании проб),Для исследования МДАиспользуютплазму и эритроциты образца крови, в котором в качестве антикоагулята был использовэн гепарин: в 1-ю пробирку помещают 0,4мл плазмы, а во 2-ю - 0,4 мл гемолизатаэритроцитов; в обе пробирки добавляют по0,1 мл свежеприготовленного 0,28 о -ноговодного раствора сернокислого железа (конечная концентрация - 0,06 О ). Смесь перемешивают и термостатируют в течение 30мин, как описано выше.По истечении времени инкубации во всепробирки добавляют по 2,5 мл дистиллированной воды и 1,0 мл 20 трихлоруксуснойкислоты (ТХУ). Образцы тщательно перемешивают,К образцам, содержащим ЭДТА и сернокислое железо, готовят контроли, против:которых необходимо колориметрироватьсоответствующие пробы. Контроль, к образцам крови с ЭДТА: 0,1 мл 5 ЭДТА+ 2,9 млдистиллированной воды+ 1,0 мл 20 о ТХУ+,0,1 мл 0,6 оТБК, Контроль к образцам кровибез ЭДТА: 0,1 мл 0,28 % водного растворасернокислого железа + 2,9 мл дистиллированной воды+1,0 мл ТХУ+ 1,0 мл 0,6 оТБКВсе образцы центрифугируют при 3000об/мин в течение 10 мин. В высокие цилиндрические пробирки помещают по 1,0 мл 0,6освежеприготовленной ТБК на дистиллированной воде и приливают надосадочнуюжидкость после центрифугирования образцов. Пробирки ставят в кипящую водянуюбаню на 30 мин, посэе чего быстро охлаждают и производят спектрофотометрическогоисследование при длине волны 535 нм; приэтом используют соответствующий контрольный раствор, против которого колориметрируют образец,Расчет количества МДА в образцахплазмы крови производят по формуле: Количество МДА в растворах эритроцитов рассчитывают аналогично за тем исключением, что в знаменателе объем седимента эритроцитов составляет 0,066 мл (с учетом разведения седимента эритроцитов водой 1 : 5 и использовали для анализа 0,4 мл гемолизатэ эритроцитов):А = Еоп480,80,где А - содержание МДА в мкмоль/л (или нмоль/мл) седимента эритроцитов, приготовленного при стандартных условиях осаждения клеток.МДАопределяют как разность МДА и МДА(для плазмы и эритроцитов соответственно.П р и м е р . В плазме и эритроцитах белых крыс исследована интенсивность процессов ПОЛ и состояние антиоксидатной активности этих систем в динамике течения ожоговой болезни (см. табл.). Показано, что интенсивность ПОЛ в плазме крови животных, выявленная по результатам анализа МДА, имеет сильную положительную корреляцию с динамикой этого процесса, определенного другим (известным) способом у этих же животных - путем исследования концентрации диеновыхконъюгатов методом спектрофотометриипри 232 нм (г = + 0,95)Выявлено, что антиоксидэнтная активность в плазме крови обожженных крыс в процессе течения ожоговой болезни по данным определения МДАимеет колебательный характер, а величины МДА-З, характеризующие этот параметр, имеют отрицательную корреляционную зависимость средней степени (г = - 0,57) с показателями,полученными при исследовании образцов . методом ЭПР-спектроскопии (отношение ЭПР-сигналов церулоплазмина и трансфер- рина сыворотки крови у тех же крыс), То есть, максимальные значения МДА-З, обнаруженные по предложенному, способу, соответствуют минимальным значениям отношения ЭПР-сигналов церулоплазмина к трансферрину, Таким образом, вышеизложенное позволяет зэключаить, что возрастание концентрации МДАсоответствует снижению антиоксидантной активности исследуемой системы. Вероятно, более низкий уровень коэффициента корреляции, найденного для МДА-З, по сравнению с таковым для МДА, можно объяснить темчто если концентрация МДАотражает состояние общей антиоксидантной активности исследуемой системы, то отношение ЭПР - сигналов церулоплазмин/трансферрин -только лишь часть антиоксидантного механизма, хотя и имеющего наиболее важноезначение в сыворотке крови(т. е. системуцерулоплазмин-трансферрин).Сильная положительная корреляция (г = 5.+ 0,76) показана для МДАэритроцитов всопоставлении с другим методом определения продуктов ПОЛ и характеризующим активность этого процесса - регистрациейконечных продуктов ПОЛ(шиффовых оснований) с помощью спектрофлуорйметра (см.табл.),МДАв эритроцитах имеет среднююотрицательную корреляцию (г = - 0,46) с активностью фермента, обеспечивающего в 15этих клетках наряду с другими энзимамиантиоксидантный эффект, что также доказывает обратную зависимость между концентрацией в эритроцитах МДАиантиоксидантной активностью системы за 20счет супероксиддисмутазы (СОД); возрастание МДАнаблюдается при падении СОД,а его снижение - при подъеме активностиэтого фермента. Так как СОД является лишьчастью антиоксидантной системы, связанной с инактивацией ПОЛ в эритроцитах, то,по-видимому, так же, как и в плазме, чтообъясняет средний уровень корреляции показателей, выявленный при анализе материала, полученного на одними тех же 30животных.Таким образом, рассмотренный примерсвидетельствует о достижении положительного эффекта при применении предложенного метода определения МДА для 35характеристики в крови интенсивности процессов ПОЛ и состояния антиоксидантнойсистемы,Способ может быть полезен и использован как в области практической (диагностика глубины и тяжести патологическихпроцессов, сопровождающихся интенсификацией процессов перекисного окислениялипидов), так и экспериментальной медицинь 1 и биологии, например, при исследовании 45и оценке фармакологических эффектов лекарственных препаратов-антиоксидантов,различных физических факторов воздействия на организм, а также в токсикологии, радиобиологии и онкологии,Формула изобретенияСпособ определения малонового диальдегида в крови, включающий отбор крови, разделение плазмы и эритроцитов, добавление к исследуемой пробе раствора серно- кислого железа в конечной концентрации 0,06и тибарбитуровой кислоты, нагревание смеси с последующим спектрофотометрическим определением окрашенного продукта, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения информативности за счет возможности одновременного анализа интенсивности перекисного окисления липидов в плазме и эритроцитах, а также характеристики состояния антиоксидантной активности этих систем, отбор крови производят в двух параллельных пробах, в первой в качестве антикоагулянта используют этилендиаминтетрауксусную кислоту, а во второй - гепарин, затем разделяют плазму иэритроциты, проводят гемолиз эритроцитов, в первую пробу плазмы и гемолизата эритроцитов добавляют этилендиэминтетрауксусную кислоту до конечной концентрации 0,5-1,5, во вторую пробу плазмы и гемолизата эритроцитов - сернокислое железо, пробы термоститируют, осаждают белок, после чего в образцах плазмы и гемолизатэ эритроцитов, содержащих этилендиаминтетрауксусную кислоту, определяют малоновый диальдегид, нарастание которого свидетельствует о возрастании интенсивности процессов перекисного окисления липидбв, а также разность оптической плотности второй и первой пробы соответственно в плазме и гемолизате эритроцитов и рассчитывают концентрацию малонового диальдегида, причем ее увеличение свидетельствует о снижении, а уменьшение - о возрастании антиоксидантной активности системы.1.Х 1Яс о ак доХ 1 ексй аойдох ао у2СкооэБ 1" 1 й 2 о Х ЭйХ1- Е ХС 1- ЗО Хо