Способ диагностики аллергии

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИК 1803873 51)5 6 01 й 33/53 41;г 1 к,: 1 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕ НИ лергического генеза у детей. Цель - повышение точности диагностики. Для этого у больных с нормальным уровнем сывороточного цЕ дополнительно готовят смесь свежей и прогретой при 56 С в течение 4 ч сыворотки крови одного и того же больного при соотношении свежей и прогретой сыворотки 1:1, Определяют содержание цЕ в смеси свежей и прогретой сыворотки и при снижении содержания 1 цЕ в смеси менее чем на 10, отсутствии изменения содержанияцЕ в сме. си или при его повышении по сравнению со свежей сывороткой диагностируют аллергию. Способ обеспечивает повышение точности диагностики на 30 - 60 по сравнению с известными способами,Изобретение отно частности к аллерголо пользовано для выявл лергического генеза у Цель предлагаемо ние точности диагносттс медицине, в ожет быть исолеваний алгии, имения забдетей,го спосо ОО С) 6 д ОО 4 6 д а - повыш ки. тВ лунки тпо 0,2 абору) с ОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕЕДОМСТВО СССРГОСПАТЕНТ СССР) ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬС(71) Ленинградский педиатрический медицинский институт(56) Инструкция по применению тест-системы иммуноферментной для определенияобщегоцЕ человека Ставропольского НИИвакцин и сывороток, 1986.(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ АЛЛЕРГИИ(57) Изобретение относится к медицине, вчастности к аллергологии, и может быть использовано для выявления заболеваний алСпособ осуществляю следующим образом.Утром натощак у больного из вены или из пальца берут 1 мл крови в пробирку. Пробирку оставляют р при комнатной температуре на 1-1,5 часа до образования сгустка, затем пробирку центрифугируют 15 мин при 1500 об/мин, сыворотку крови отсасывают и разливают на 3 пробы; проба А - 0,05 мл сыворотки крови, проба В - 0,1 мл сыворотки, проба С,1 мл сыворотки. Пробу С прогревают при 56 С в течение 4 ч, а затем все три пробы замораживают и хранят до момента исследования при -20 С в .морозильной камере,1. Этап исследования - измерение уровня 1 цЕ в пробе А (осуществляют в полном соответствии с инструкцией по применению тестсистемы, иммуноферментной для определения общего 1 цЕ человека; Ставропольского НИИ вакцин и сывороток), следующим образом: 1. Пробу А, содержащую 0,05 мл свежей сыворотки крови больного размораживают и разводят раствором ЛЬ 1 (прилагается к набору для определения ц Е) 1:10, т,е, к 0,05 мл исследуемой сыворотки прибавляют 0,45 мл раствора М 1,2. Инкубация со стандартом 1 цЕ и исследуемыми образцами. Освобождают планшет, прилагаемый к набору для определения 1 цЕ, от упаковки и маркируют, В кажду лунку 1 ряда планшета по вертикали вносят по 0,2 мл раствора М 1(прилагается к набору для определения 1 цЕ) в качестве отрицательного контроля.А и В второго и третьего ряда внося мл стандарта цЕ (прилагается к нсодержанием 100 кЕ/л положительный контроль). Затем в лунки В, С, О и т,д, этих рядов вносят по 0,2 мл раствора ч. 1, Содержимое лунок В тщательно перемешивают с помощью пипетки, 5 раз набирая и сбрасывая жидкость, После перемешивания содержимое лунок В второго и третьего ряда в количестве 0,2 мл последовательно переносят в лунки С, из лунок С - в лунки О и т.д. и т.д., каждый раз аналогично перемешивая и осуществляя таким образом двух- кратное разведение стандарта цЕ от 100 кЕ/Л до концентрации/0,8 кЕ/л. из последних лунок лишние 0,2 мл содержимого отбрасывают. Во все другие лунки вносят по 0,2 мл исследуемых сывороток(проба А разведения 1;10) в дубликатах. Планшет плотно закрывает крышкой и помещают в термостат при температуре 37 С на 1 час для образования комплекса антиген-антитело.3. Отмывка планшета, Планшет вынимают из термостата, жидкость из лунок удаляют отсасыванием с помощью пипетки Пастера и водоструйного насоса. Затем каждую лунку доверху заливают раствором М 1 (прилагается к набору для определения цЕ (на 2-3 мин., жидкость вновь удаляют, Всю процедуру промывания повторяют не менее 3 раз, По окончании отмывки планшет кладут на фильтровальную бумагу вверх дном для осушения,4, Инкубация с коньюгатом. В каждую лунку планшета вносят по 0,2 мл раствора конъюгата М 3 (прилагается к набору для определения цЕ), планшеты закрывают крышкой и помещают в термостат при 37 С на 1 час.5, Отмывку планшета проводят в пункте 3, повторивпроцедуру не мене 5 раз.6, Григотовление субстратной смеси и инкубация планшетов, Субстратную смесь готовят ех тевроге. На 3 планшета к 60 мл раствора М 5 добавить 0,06 млраствора й.6 (реактивы для растворов М 5 и В 6 прила гаются к набору для определения 1 цЕ) и тщательно перемешивают стеклянной палочкой, 8 каждую лунку отмытых планшетов вносят по 0,2 мл свежеприготовленной субстратной смеси. Инкубируют в течение 20 - 30 минв зависимости от интенсивности окрашивания, при комнатной температуре в защищенном от света месте, В лунках планшета, где прошла реакция, появляется желток окрашивание разной интенсивности. Лунки первого контрольного ряда должны оставаться бесцветными, Реакцию останавливают добавлением в каждую лунку 0,05 мл 50 ф раствора серной кислоты, предварительно убедившись в том, что показания оптической плотности стандарта 1 цЕ в 100 кЕ/л находятся в пределах 0,5-1,0.7, Учет результатов, Фотометрическаяоценка. Измерение поглощения света окрашенными растворами проводят на фотометре Т 11 ег 1 еК МцВМап МС при длине волны 492 нм, установив режим прибора на автоматический вычет показаний оптической плотности контрольного 1 ряда планшета из 10 показаний оптической плотности исследуемых образцов, Анализ считывается действительным если:- ни один из показателей отрицательного контроля не превышает оптическую плот ность 0,1;- показатели максимального положительного контроля (стандарт 1 цЕ в 100 кЕ/л превышает оптическую плотность в 1,0,Для каждого разведения стандарта цЕ 20 определяют среднюю величину показателяоптической плотности, На графике, построенном на маштабно-координатной бумаге марки ПЛН (прилагается к наборудля определения 1 цЕ) по оси абсцисс откладывают 25 значения стандартовцЕ, а по оси ординат- показатели оптической плотности, На основании средних показателей оптической плотности, определенных для каждого стандарта, строят калибровочную кривую, 30 По калибровочной кривой на основаниисреднего показателя оптической плотности каждого образца вычисляют концентрацию цЕ е пробе А (свежая сыворотка больного, разведенная 1:10) с учетом разведения. Пол ученный результат сравнивают с возрастными нормамицЕ/М + 16), Если полученный результат превышает возрастную норму цЕ, на этом исследование прекращают, а если уровнеь 1 цЕ в исследуемой сыворотке 40 находится в пределах возрастной нормы,проводят 2 этап исследования. 2 этап исследования - измерение соержания цЕ в свежей сыворотке (проба В) и смеси свежей и прогретой сыворотки (проба 8) и смеси свежей и прогретой сыворотки (проба В + проба С). Размораживают пробы В и С, В отдельной пробирке готовят смесь свежей и прогретой сыворотки, для чего из пробы В отбирают 0,05 мл сыворотки из из пробы С50 отбирают 0,05 мл сыворотки, перемешивают их и доливают 0,4 мл раствора М 1 (прилагается к набору для определения цЕ) с тем, чтобы конечное разведение свежей сыворотки составляло 1:10, К оставшимся 0,05мл свежей сыворотки в пробе В и к 0,05 мл сыворотки е пробе С добивают по 0,45 мл раствора М 1 (конечное разведение обеих сывороток 1:10), Измеряют содержание 1 цЕ в пробах В, С и В+С так же, как на 1 этапе исследования, т,е, повторяют пункты 1-7первого этапа, В пробе С содержание 1 дЕдолжно равняться нулю, Определяют процент связывания 1 дЕ прогретой сывороткойПо формуле; х 100% 100 -где В - содержание 19 Е в свежей сыворотке (проба В), В + С - содержание 1 дЕ в смеси свежей и прогретой сыворотки (проба В+проба С), Аллергию диагностируют, если содержание 1 дЕ в смеси свежей и прогретой сыворотки по сравнению со свежей сывороткой снижается менее чем на 10%, не изменяется или повышается.С использование предлагаемого способа было обследовано 139 детей с различными аллергическими заболеваниями (бронхиальная астма. астматический бронхит, аллергический ларинготрахеит, поллиноз, экзема, нейродирмит, крапивница), у кОторых аллергия подтверждена кожными (скарификационными) и провокационными тестами с различными аллергенами (домашняя пыль, пыльца растений, эпидермальные и пищевые аллергены). Эти же больные были обследованы также с использованием способа-прототипа. Результаты сравнения точности предлагаемого способа и способа- прототипа представлены в таблице.Из данных таблицы видно, что использование заявленного способа позволяет повьсить точность диагностики на 40% по сравнению со способом прототипом. П риме р 1. Больная Таня Ш.,1 г 9 мес.,поступила для обследования в детскую больницу М. 1 г, Ленинграда 7.01,89 г. с диагнозом "рецидивирующий обструктивный бронхит", Из анамнеза известно, что девочка больна с декабря 1987 г., когда на форе острого респираторно заболевания появилась экспираторная одышка, сухой, навязчивый кашель, Лечилась антибиотиками, отхаркивающими средствами, но одышка, кафель, сухие хрипы в легких на фоне нормаЛьной или субфебриэльной температуры рецидивировали каждые 1-2 месяца.8.01,89 г. взята кровь для определения содержания 19 Е, Сыворотку крови больной распределяли на 3 пробы: проба А - 0,05 мл сыворотки крови, проба В - 0,1 мл сыворотки, проба С - 0,1 мл сыворотки пробу С прогрели при 56 С в течение 4 часов, затем все три пробы заморозили и хранили до момента исследования при -20 С в морозилной камере, Исследование 1 дЕ проведено 10.01,89 г,1 этап исследования - измеряли уровень19 Е е пробе А следующим образом, второго и третьего ряда в количестве 0,2 мл25 последовательно перенесли в лунки С, из . лунок С - в лунки О и т.д., каждый рэз ана 30 35 40 45 50 55 5 10 15 20 1. Пробу А, содержащую 0,5 мл свежей сыворотки крови больной разморозили и развели раствором М 1(прилагается к набору для определения 1 дЕ Ставропольского НИИ вакцин и сывороток) 1: 10, т.е. к 0,05 мл исследуемой сыворотки прибавили 0,45 мл раствора М .1.2, Инкубация со стандартом 19 Е и исследуемым образцом, Освободили планшет, прилагаемый к набору для определения 19 Е, от упаковки и примаркироеали, В каждую лунку 1 ряда планшета по вертикали внесли по 0,2 мл раствора М 1 (прилагается к набору для определения 1 дЕ) в качестве отрицательного контроля, В лунки А и В второго и третьего ряда внесли по 0,2 мл стандарта 19 Е (прилагается к набору) с содержанием 100 кЕ/л (положительный контроль). Затем в лунки В, С, О и т,д. этих рядов внесли по 0,2 мл раствора М 1. Содержимое лунок В тщательно перемешали с помощью пипетки, 5 раз набирая и сбрасывая жидкость. После пе ремешива ния содержимое лунок В логично перемешивая и осуществляя таким образом, двухкратное разведение стандарта 1 дЕ от 100 кЕ/л до концентрации 0,8 кЕ/л. Из.последних лунок лишние 0,2 мл содержимого отбрасывают. В две другие лунки внесли по 0,2 исследуемой сыворотки (проба А, разведенная 1:10). Планшет плот- но закрывают крышкой и помещают в термостат при температуре 37 С на 1 час дляобразования комлекс-саантиген-антитело,. 3. Отмывка планшета, Планшет забралииз термостата, жидкость из лунок удалила отсасыванием с помощью пипетки Пастера и водоструйного насоса, Затем каждую лунку доверху залили раствором М 1 (прилагается к набору для определения 1 дЕ) на 2 - 3 мин, жидкость вновь удалили. Всю процедуру промывания повторили 3 раза, По окончании отмывки планшет кладут на фильтровальную бумагу вверх дном для осушения,4, Инкубация с коньюгатом, В каждую лунку планшета внесли по 0,2 мл раствора коньюгата М 3 (прилагается к набору для определения 1 дЕ), планшеты закрыли крышкой и поместили в термостат при 3 С на 1час,5, Отмывку планшета проводили, какописано в пункте 3, повторив процедуру 5раз,6. Приготовление субстратной смеси иинкубация планшетов. Субстратную смесьготовили ех тетроге. к 60 мл раствора М 5 добавили 0,06 мл растора М 6 (реактивы длярастворов М 5 и М 6 прилагаются к набору для определения 1 цЕ) и тщательно перемешали стеклянной палочкой. В каждую лунку отмытых планшетов внесли по 0,2 мл свеже-.приготовленной субстратной смеси. Инку бировали в течение 20 мин, при комнатной температуре в защищенном от света месте, В лунках планшета, где прошла реакция, гюявилось желтое окрашивание разной ин, тенсивности, Лунки первого контрольного 10 ряда остались бесцветными. Реакцию остановили добавлением в каждую лунку 0,05 мл 50 раствора серной кислоты, предварительно убедившись в том, что показания оптической плотности стандарта цЕ в 100 15 кЕ/л находятся в пределах 0,5-1,0.7. Учет результатов. Фотометрическая оценка. Измерение поглощения света окрашенными растворами проводили на фото- метре Тйегсе 1 с МцЮвсап МС при длине 20 волны 492 нм, установив режим прибора на автоматический вычет . показаний оптической плотности контрольного первого ряда планшета из показаний оптической плотности исследуемых образцов, Анализ считался 25 действительным, т.к. ни один иэ показателей отрицательного контроля не превышал оптическую плотность 0,1, а показателимаксимального положитЕльного контроля (стандарт 1 дЕ в 100 кЕ/л) превышал оптиче скую плотность в.1,0.Построение калибровочнойкрИвой, Длякаждого разведения стандарта 1 цЕ определяли. среднюю величину показателя оптической плотности, На графике, построенном 35 на масштабно-координатной бумаге марки ПЛН по оси абсцисс откладывали значения стандартов 1 дЕ, а по оси ординат - показатели оптической плотности. На основаниИ средних показателей оптической плотно сти, определенных для каждого стандарта, построили калибровочную кривую, По калибровочной кривой на основании среднего показателя оптической плотности образца . А сыворотки, поставленного в дубле, вычислили концентрацию 1 цЕ в пробе А с учетом разведения 1.10, Концентрация 1 дЕ в свежей сыворотке крови больной Тани Ш. 1 года 9 месяцев составила 16 кЕ/л, Возрастная норма цЕ в этом возрасте составляет 23 50 к Е/л (М 10), т.е. содержание 1 ц Е в сыворотке крови данной больной находится в пределах возрастной нормы и по прототипу такая больная ие входит в группу больных аллергическими заболеваниями. Поскольку уро вень 1 дЕ в сыворотке данной больной находился в пределах возрастной нормы был проведен второй этап исследования - измерение содержания 1 цЕ в свежей сыво ротке той же больной (проба В) и в смесисвежей о прогретой сыворотки (проба В + проба С). Разморозили пробы В и С, В отдельной пробирке приготовили смесь свежей и прогретой сыворотки, для чего из пробы В отбирали 0,05 мл сыворотки и иэ пробы С отбирали 0,05 мл сыворотки перемешивали их и доливали 0,4 мл раствора М 1 (прилагается к набору для определения 1 дЕ) с тем, чтобы конечное разведение свежей сыворотки составило 1;10, К оставшимся 0,05 мл свежей сыворотки в пробе В и К 0,05 мл прогретой сыворотки в пробе С доливали. по 0,45 мл раствора М 1 (конечное разведение обеих сывороток 1:10). Измеряли содержание 1 дЕ в пробах В, С, В+С так же, как на В пробе С содержаиие 1 дЕ равнялось нулю, в пробе В было равным 16 кЕ/л, в пробе В+С - 15 кЕ/л. Определили процент связывания 1 дЕ прогретой сывороткой по формуле:10016 - 15что было равно 100 16 х 100% = 6%, т.е, прогретой сывороткой связывалось только 6% 1 дЕ, содержащегося в свежей сыворотке. По данным заявленного способй данная большая входила в группу больных аллергическими заболеваниями, что было впоследствии подтвреждено положительными скарификационными тестами с аллергенами домашней пыли) домашняя пыль серии 268, домашняя пыль серии 216) и положительным эффектом от проведенного курса специфической игипосенсибилизации (при наблюдении в течение года после проведенного курса гипосеисибилиэации у девочки зарегистрировано только два непродолжительных эпизода бронхиальной обструкции - в течение 1-2 дней, которых легко снималась приемом водной микструры с эуфиллином),История больной Тани Ш, М 314.П р и м е р 2, Больной Филипп М 13 лет, поступил для обследования в аллергологическое отделение детской больницы Я 1, 3,04.89 г. (История болезни М 4316) для обследования по поводу рецидивирующей крапивницы. Болен с 3 лет, когда впервые после перегрева иа солнце появилась генерализованная крапивница, которая держалась в течение недели. В последующем проявления крапивницы отмечены при воздействии таких неспецифических факторов, как физическая нагрузка, переохлаждеиие, на фоне острых респираторных заболеваний. С помощью прототипа у больного измерено содержание общего 1 цЕ в сыворотке крови, которое было равным 68 кЕ/л (возра1803873 20 25 30 35 40 Сравнение точности заявляемого способа и способа-прототипа стная норма - до 85 кЕ/л), т.е. по данным прототипа больной не входил в группу больных с аллергическими заболеваниями. При оценке содержания 1 дЕ в смеси свежей и прогретой сыворотки и в свежей сыворотке по заявленному способу оказалось, что содержащие 1 дЕ в свежей сыворотке и в смеси свежей и прогретой сыворотки было равным (68 кЕ/л), т.е. (дЕ не связывался прогретой сывороткой, что свидетельствовало в пользу аллергической природы заболевания у данного больного, При постановке кожных скарификационных проб выявлена сенсибилизация к облигатным пищевым аллергенам (белок куриного яйца , треска , апельсин , клубника ). Рекомен-. дована гипоаллергенная диета, которую больной строго соблюдал. При наблюдении в течение года рецидивов крапивницы не отмечено.П р и м е р 3, Арсентий С 11 мес. (история болезни М 8063),поступил для обследоваНия в и лечения в детскую больницу 1 Ф 1 26,06,89 г, с диагнозом рецидивирующий средний отит, Болен с 2 мес., когда после перевода на искусственное вскармливание ежемесячно стал болеть отитами. Антибактериальная терапия была не эффективной. Заподозрен аллергический генеэ заболе вания. С помощью способа прототипа определен уровень сывороточного 1 дЕ, который был равен 11 кЕ/л (возрастная норма 13 кЕ/л), т,е. по данным способа-прототипа больной не страдал аллергическим заболеванием. С помощью предлагаемого способа определили содержание 1 дЕ в свежей сыворотке и в смеси свежей и прогретой сыворотки, которое было равно соответственно 11 КЕ/л и 13 кЕ/, т.е. в смеси свежей и прогретой сыворотки содержание дЕ было выше, чем в свежей сыворотке и больной мог врыть отнесен к аллергологическим больным, Поставлены кожные пробы с аллергенами, которые оказались положительными с аллергенами коровьего молокаи с аллергеном белка куриного яйца, Перевод больного на безмолочную гипоаллергенную диету привел к стиханию симптомов отита. Под контролем отоларинголога была проведена провокационная проба с коровьим молоком, которая привела к возобновлению симпотов отита, После выписки из стацио 10 нара больной строго соблюдал безмолоч. ную диету, при наблюдении в течение 14 месяцев рецидивов отита не отмечено,Использование предлагаемого способа позволяет повысить точность диагностикиаллергии на 40 по сравнению со способом-прототипом за счет воэможности выявления специфических для аллергии особенностей антигенной структуры молекулы дЕ и наличия в сыворотке крови специфических для аллергии ингибирующих факторов, Способ может быть использован при скриннинговых массовых обследованиях для отбора деталей, подлежащих аллергологическому обследованию, а также при сложностях дифференциальной диагностики аллергических и неаллергических заболеваний,Ф ор мул а и зоб рете ни я Способ диагностики аллергии путем определения содержания иммуноглобулина Е в свежей сыворотке крови больного, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности способа при обследовании детей,дополнительно лицам с нормальными показателями иммуноглобулина определяют содержащие иммуноглобулина Е в смеси свежей и прогретой при температуре 56 С в течение 4-х часов сывороток, взятых в соотношении 1:1 и при снижении его количества менее, чем на 10 или отсутствии изменений, или повышении по сравнению с показателями свежей сыворотки диагностируюталлергию.