Способ определения чувствительности к иммуномодуляторам

Фр СОЮЗ СОВЕ ТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИК П 9) 1777078 А й ЗЗ/483(51) 5 6 ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТВЕДОМСТВО СССР(ГОСПАТЕНТ СССР) ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН К АВТ шение точности способа, а также снижение побочного действия, Сущность изобретения: проводят измерение экспрессии поверхностных дифференцировочных антигенов кластера СО 23, а также антигенов главного комплекса гистосовместимости И класса по интенсивности флюоресценции при инкубации с моноклонэльными антителами ИПОи ИКОв опытных пробах по отношению к контрольным с интегральным учетом интенсивности флюоресценции клеточной суспензии спектрофлюориметрически, 3 табл. нтр радиацион к, Д,А.Базыка,Ю.Л,Коноплева М 1, р.33-38.ИЯ ЧУВСТВИДУЛЯТОРАМ на, аллерголощение и повылекарстве рану зрит крови с л оценке по ски по ск лиза, Сп ин формат ледовани также при лада ющих ствием. нных в роцито екарст врежде орости особ ивен, о ю имму тестир повре(фв-Известен способ прогнозирования чу ствительности нейтрофилов к иммуномодуляторэм со стимуляцией зимоэаном, продигиозаном, трипсином, пептидогликэнами, лизоцимом, левэмизолом по восстановлению нитросинего тетразолия с визуальным учетом, К достоинствам способа относится быстрота исполнения, к недостаткам - отсутствие возможносги определения чувствительности лимфоиитов и их субпопуляций, применение токсических веществ (пиридин),ОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(71) Всесоюзный научн 4 й ценой медицины АМН СССР(57) Использование: медицгия, иммунология, Цель: упр Изобретение относится к медицине, в частности к аллергологии и иммунологии, и может быть использовано в биологии,Определение п чтго чувствительности иммунокомпетентных клеток к воздействию иммунокорректоров имеет важное значение в связи с различными эффектами их воздействия на субпопуляции иммунокомпетентных клеток, что приводит к развитию нежелательных побочных эффектов,Известны способы оценки и отбора эдаптогенных препаратов по их эффективности в эксперименте. Способ осуществляется введением экспериментальным животным изучаемых препаратов с учетом их воздействия по летэтельности. Однако указанный способ применим только при определении общих механизмов действия препаратов и не учитывает как индивидуальных особенностей, так и особенностей воздействия нэ иммунную систему,Известен также способ автоматизированной оценки индивидуальной лекарственной чувсгвигельности по свойству еществ повреждать мембв и ч)тго при инкубации венными препаратами и ния спектрофотометричереакции кислотного гемопрост в выполнении и днако не применим к исснокомпетентных клеток, а овании препаратов. не обждэющим мембрану дей 1777078фракции по розеткообразованию с эритроцитами барана (Е-РОК и Еа-РОК) и фагоци- .тарной активности, К недостаткам способа 10 15 ки эффективности иммуномодулирующихпрепаратов в реакции бластной трансформации. Иммунокомпетентные клетки пацииммуномодуляторам производится измерение экспрессии поверхностных дифференцировочных антигенов кластера СО 23, 50 55 Известны также способы индивидуального прогнозирования эффективности левамизола у больных талассемией путем выделения мононуклеаров, инкубации их с левэмизолом (опытная проба) или контрольным раствором и определения в пробах количества Т-лимфоцитов и их активной относится отсутствие стандартизации в связи с зависимостью от качества эритроцитов, применение разнородных методических приемов при оценке количества розеткообразующих и фэгоцитирующих клеток, отсутствие оценки В-клеток.Наиболее близким к изобретению техническим решением является способ оценента инкубируют с иммуномодулятором или митагеном, после чего исследуют изменения пролиферативной активности по включению ЗН-тимидина с автоматизированным учетом на сцинтилляционном счетчике или подсчитывают количество бластных клеток под микроскопом. Метод считается достаточно информативным, К недостаткам его относятся длительность инкубации (от 72 ч при исследованиях с РНА до 96 ч при исследовании активности иммуномодуляторов. аллергенов и др,) биологически активных веществ, низкая эффективность при исследовании воздействия митогенов на очищенные субпопуляции клеток в связи с необходимостью их предварительного выделения из суспензии мононуклеаров с помощью проточной цитофлюориметрии или другими дополнительными способами с проведением всех указанных этапов в стерильных условиях.Целью изобретения является упрощение способа и повышение его точности. а также снижение побочного действия. Указанная цель достигается тем. что вспособе определения чувствительности к а также энтигенов главного комплекса гистосовместимости П класса по интенсивности флюоресценции при инкубации с моноклональными антителами ИПОи ИКОв опытных пробах по отношению к контрольным с интегральным учетом интенсивности Флюоресценции клеточной суспензии спектрофлюориметрически, Моноклонэльные антителэ ИПОпервоначально разработаны для выявления количе 25 30 35 40 45 ственного содержания В-бластов человека, ИКО- для определения количества нормальных и лейкозных клеток, несущих НЕАОг антигены,П р и м е р. Данные клинико-иммунологического мониторинга больного М., 40 лет. При обследовании 23.05,90 содержание лейкоцитов 4,6 х 10 в 9/л; лимфоцитов 33 о(1,52 х 10 в 9/л), СОЗ + 37,9(0,57 х 10 в 9/л), СО 4 + 12,4 о(0,19 х 10 в 9/л), СО 8 + 20,8 ф(0,32 х 10 в 9/л), СО 4 + /8+ 0,60. СО 22 + 17,9 (0,27 х 10 в 9/л), НМ-Ог + 11,8 о(0,18 х 10 в 9/л), У больного взята кровь иэ вены в количестве 5 мл, разведена в 2 раза забуференным раствором Хэнкса (0,1 М фосфатный буфер, рН 7,4). Суспензия мононуклеаров выделена нэ рефрижераторной центрифуге К(ГДР) в градиенте плотности фиколла(РЬаггпаса Оацпозссз) - верографина, б - 1,076. Суспензия доведена до концентрации 1 х 10 клеток в мл нэ проточном цитоанализатореаЬогзса 3 е РЯ- РЯА(Венгрия). В лунки 96-луночного планшета (Ров) внесено по 50000 клеток, иэ расчета 1 опытная и 1 контрольная лунки для моноклонального антитела ИПОи столько же для ИК 0-1, В опытные лунки внесено по 50 мкл тактивина в концентрации 2 мг/мл. Планшет инкубировали при 37 С в течение 60 мин, после этого осторожно стряхнули и внесли по 20 мкл моноклональных антител в рабочем разведении. После 45 мин инкубации при постоянном смешивании на вортекс-миксере отцентрифугировали. планшет при 1009 в течение 5 мин и отмыли 0.9 раствором натрия хлорида. В опытные и контрольные лунки внесли по 20 мкл меченных флюоресцеина иэотиоцианатом антител к РаЬ-фрагментам иммуноглобулинов мыши. инкубировали 60 мин в темноте при перемешивании, После инкубации суспензию клеток отмыли физиологическим раствором, предварительно проверенным на отсутствие флюоресценции, в лунках оставили по 20 мкл клеточной суспензии, Измерение флюоресценции проводили на одноканальном спектрофотометре - флюориметре для 96-луночных планшетов "Яаща РЕ 2" производства Саг Ее 1 зз (ГДР) при длине волны возбуждения 488 нм, светофильтре фотоумножителя с максимумом трансмиссии 530 нм, в качестве стандартного образца испольэовали темное поле, опорных - 3 лунки, заполненных 0,9 раствором натрия хлорида. Результаты получали в виде показателей для каждой пробы, коэффициенты вычисляли по Формуле А К = -Ь10 15 ных клеток 20 25 30 35 40 45 где К - коэффициент экспрессии (чувствительности к иммуномодулятору);А - показатель флюоресценции для лунки с иммуномодулятором;Ь - показатель флюоресценции для контрольной лунки,Результаты исследования чувствительности к иммуномодуляторам: ИКО: К для тактивина 1,19, вилозена 0,99, ИПО: К для тактивина 1,05, вилозена 1,02. В соответствии с данными обследования (затяжное течение хронического обструктивного бронхита, сниженное относительное и абсолютное содержание СОЗ+, С 04+ лимфоцитов, соотношения С 04+/8+, количества клеток, экспрессирующих НЮ-Ог, чувствительности субпопуляции к тактивину 1 и чего) принято решение о назначении курсовой терапии тактивином. После проведенной комплексной терапии с включением тактивина отмечено значительное улучшение клинического состояния, При обследовании 27.06.90 содержание лейкоцитов 5,7 х 10 в 9/л; лимфоцитов 29(1,65 х 10 в 9/л), СОЗ + 44,1 (0.73 х 10 в 9/л), СО 4 + 28,4 (0,47 х 10 в 9/л), СО 8+ 21,2 ф(0,35 х 10 в 9/л), С 04+/8 + 1,34, С 022 + 26,7 (0,45 х 10 в 9/л), Н.А-Рг+ 22,3 ф(0.37 х 10 в 9/л), ИКО: К для тактивина 1, 04, вилозена 1,03; ИПО: К для тактивина 1,02, вилозена 1,03. Таким образом, отмечена корреляция между данными исследования 1 п ч 1 кго и клинической эффективностью. Отдаленные результаты терапии изучены через 6 мес. и показали удовлетворительное состояние больного и нормальные значения показателей иммунного статуса.В табл.1-3 представлены данные сопоставительного анализа исследования чувствительности к тактивину, вилозену, предниэолону, по способу-прототипу и заявляемому способу,Как видно из табл.1, отмечена корреляция экспрессии Н.А-Ог антигенов (антитело ИКО) при исследовании суммарной флюоресценции клеточной суспензии при инкубации с иммуномодулятором и индекса включения ЗН-тимидина при инкубации с РНА и тактивином, Экспрессия антигена С 023 (антитело ИПО) по данным суммарной флюоресценции коррелирует в меньшей степени, что связано с тем. что антиген характерен для В-иммунобластов и отражает активацию В-звена, наступающую в результате изменений Т-звена иммунитета.Из табл.2 - 3 видно, что использование заявляемого способа возможно при определении чувствительности к различным модуляторам, обладающим как стимулирующим, так и ингибирующим действием на пролиферативную активность иммунокомпентентУказанный способ использован в Институте клинической радиологии ВНЦРМ АМН СССР при исследовании чувствительности к иммуномодуляторам (тактивин, вилоэен) более чем у 800 больных с проявлением иммунодефицитов. подвергшихся воздействию ионизирующих и неионизирующих излучений. Отмечена положительная коррелятивная зависимость с результатами назначения в необходимых случаях иммунокорригирующей терапии (г -0,76), что свидетельствует о полученном положительном эффекте - улучшении состояния здоровья больных,Формула изобретения Способ определения чувствительности к иммуномодуляторам, включающий инкубацию иммунокомпетентных клеток с испытуемым препаратом, с последующей оценкой функционального состояния клеток по регистрируемому биофиэическому показателю,отличающийсятем.что,сцелью повышения точности способа, его упрощения, а также снижения побочного действия, инкубацию проводят в присутствии моноклональных антител ИКОи ИПО-З, а функциональное состояние клеток оценивают по уровню флуоресценции, при этом регистрируют величину флуоресценции в пробе, не содержащей испытуемый препарат, и в пробе с препаратом и затем рассчитывают их. соотношение.177707 Таблица 1 Сравнительный анализ результатов исследования чувствительности к тактивину(концентрация 2 мг/мл в реакции бластной трансформации и по измерению флюоресценции клеточной суспензии с моноклональными антителами ИПОи ИКОспектрофлюориметрически на анализаторе "Яопа РЕ 2"(Саг 2 езз, ГДР), Мо и/и Индекс активации в РБТЛ Коэффициент экспрессии смоноклональными антителами Номер исследованияИПОИКО - 1 0,79 0,58 0,83При расчете не включались данные по наблюдению Мо 90 3456 диагноз - острый лимфобластный лейкоз) в связи с особенностями экспрессии антигенов в зависимости от типа моноклональной пролиферации,Таблица 2 Сравнительный анализ результатов исследования чувствительности к вилозену(концентрация 5 мг/мл) в реакции бластной трансформации и по измерению флюоресценции клеточной суспензии с моноклональными антителами ИПОи ИКОспектрофлюориметрически на анализаторе "Яита РЕ 2". 12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Коэффициент корреляции по отношению кга е 4 г 90/3448 90/3449 90/3450 90/3451 90/3452 90/3453 90/3454 90/3455 90/3456 90/3457 90/3458 90/3459 90/3460 90/3461 90/3462 8,66 20,17 22.63 13,43 12,37 11,91 17,35 22,71 5,03 23.88 22,34 20,71 20,23 17,15 14,80 9,59 18,19 23,29 16,58 9,69 10,39 11,12 19,76 5.83 17,80 22,01 20,43 11,27 9,68 16.32 1,21 1,07 1,20 1,00 0,84 0,78 1,06 .1,11 2,60 1.22 1,26 1,17 1,13 1,00 1,00 0,92 1,21 1,80 1,06 0,83 0,92 0,94 0,99 4,51 0,95 1,30 1,13 1,05 0,88 1,02177707 ФаблИца 3 Сравнительный анализ результатов исследования чувствительности к преднизолону(концентрация 3 мкг/мл) в реакции бластной трансформации и по измерению флюоресценции клеточной суспензии с моноклональными антителами ИПО-З и ИКОспектрофлюориметрически на анализаторе "Запать РЕ 2"Составитель Д.БазыкаТехред М,Моргентал Корректор И.Шулла Редактор Г.Бельская Производственно-ил.ятельский комбинат "Патент", г. ужгород, ул,Гагарина, 101 Заказ 4119 Тираж ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5