Способ определения активности глутатионтрансферазы

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИК 5 С 12 О 1/48 КО АВ ИДЕТЕЛЬСТ ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМРИ ГКНТ СССР(71) Институт эволюционной физиологии ибиохимии им. И.М. Сеченова АН СССР(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ГЛУТАТИ О НТРАН СФ Е РАЗ Ы(57) Использование: биохимия, исследование метаболизма пестицидов и лекарственных веществ, уровня загрязненности Изобретение относится к биохимии, точнее к способам определения активности ферментов, в частности к определению активности глутатионтрансферазы (КФ 2.5.1.18), которое используется для исследования метаболизма пестицидов и лекарственных веществ, уровня загрязненности водной среды ксенобиотиками.Известен способ титрометрического определения активности глутатионтрансферазы в реакции восстановленного глутатиона с алкилгалогенидами. Способ состоит втитровании 5 мМ ИаОН образующейся в результате реакции галогеноводородной кислотььК недостаткам метода следует отнести то, что он требует непрерывного поддержания рН 7,2 без применения буферного раствора, что снижает точностьи воднои среды ксенобиотиками. Сущность изобретения: прямое фотометрическое определение продукта ферментативной реакции глутатиона или инициатора реакции - натриевой соли 7-гидроксиН-феноксазин 3-ОН-оксида (резазурин-Иа). Реакционная смесь содержит фосфатнь 1 й буфер, глутатион и ферментный препарат, Реакция инициируется добавкой резазурина-йа. Сразу измеряют увеличение поглощения продукта реакции при длине волны 573 нм или уменьшение поглощения инициатора реакции при 598 нм, Предел чувствительности метода 4,7 10 М. Метод позволяет вести кинетические наблюдения за ходом реакции. 1 ил. воспроизводимость метода. Кроме того, метод требует значительного расхода времени (около 1 ч).Известны колориметрические методы определения активности глутатионтрансферазы, которые можно подразделить на определение содержания нитрит-ионов, появляющихся в реакционной смеси в результате реакции; определение цианидионов; определение п-нитрофенола,Активность глутатионтрансферазы определяется в реакциях глутатиона с нитроалканами (нитропропан, тринитроглицерин и т.д,), Способ состоит в инкубации фермента с реакционной смесью, содержащей восстановленный глутатион, буферный раствор и субстрат с последующим отбором аликвот, добавлением сульфаниламидного реагента, затем дигидрохлорида К-(1-нафтил)зтилен1759874 3диамина и, после 20 мин инкубации, измерении на фотоэлектроколориметре (ФЭК) сфильтром на 540 нм.Недостатком метода является то, что онне позволяет вести кинетические наблюдения за ходом реакции, требует. отдельного .процесса проявления, длителен (около 1 ч).Активность глутатионтрансферазы из-.меряется в реакциях:глутатиона с органическими тиоцианатами; Способ состоит впроведении ферментативной реакции всмеси, содержащей фосфатный буфер, глутатион, органический тиоцианат и фермент,последующей остановке реакции добавлением М-этилмалеимида, затем хлорамина Ти новой инкубации смеси. Затем добавляютпиразолоновый реагент и измеряют оптическое поглощение при 618 нм после 20 мининкубации,К недостаткам метода следует отнестиневозможность кинетических наблюденийза ходом реакции. снижение точности определения из-за летучести образующегося цианида, существенное исключение результатов определения трудйоустранимымипримесями неорганических тиоцианатов, атакже его длительность (около 50 мин),Активность глутатионтрансферазы определяют в реакции тиолиза и-нитрофенилацетата глутатионом. Способ состоит впрямом колориметрическом определенииобразующегося в результате реакции и-нитрофенола. Реакционная смесь содержит буферный раствор, восстановленныйглутатион и п-нитрофенилацетат,Недостатками метода являются подверженность субстрата неспецифическому каталитическому разложению при высокихконцентрациях белка в пробе, повышенные.требования к чистоте реагентов, в том числебуферных солей. Коэффициент экстинкциип-нитрофенола 8790 М смпри длине волны 400 нм, Граница чувствительности около0,1 мкмоль;Наиболее широко применяемым (базовым) и близким по чувствительности и быстроте определения к предлагаемому способуявляется способ спектрофотометрическогоопределения активности глутатионтрансферазы в реакции восстановленного глутатионас 2,4-динитрохлорбензоломЯ по схеме: огнищ сжзн орс зсчю гт фиг но, Способ состоит а прямом спектрофотометрическом определении концентрации продукта реакции 3-(2,4-динитрофенил)-глутатиона. В определении используются следующие реагенты: 0,5 М фосфатный буфер,рН 6,5; 10 мМ раствор восстановленногоглутатиона в дистиллировайной воде; 50 мМ5 раствор 2,4-динитрохлорбензола в этаноле.На 3 мл спектрофотометрическую кювету необходимо 0,6 мл буфера, 0,3 мл раствора глутатиона, 0,06 мл раствора2,4-динитрохлорбензола в, этаноле и раз 10 бавленный ферментный препарат. Такимобразом, конечные концентрации реагентов в пробе составляют 0,1 М фосфатныйбуфер, 1 мМ глутатион, 1 мМ 2,4-динитрохлорбензол. Измерение оптической плотно-15 сти ведут при длине волны 340 нм в течение1 - 3 мин после инициации реакции добавкой2,4-динитрохлорбенэола,К недостаткам этого метода, являющегося прототипом изобретения, следует от 20 нести то, что для измерений используетсякварцевая оптика. так как исследуемая полоса оптического поглощения находится награнице области поглощения обычногостекла: измерения могут вестись только на25 одной длине волны (на одном пике поглощения), что не позволяет контролировать устойчивость продукта реакции при работе сполиферментными системами или с неочищенными экстрактами тканей, Кроме того, в30 качестве растворителя для субстрата используется этанол, в связи с чем он всегдаприсутствует в реакционной смеси, Молярный коэффициент экстинкции продукта реакции 9600 М см , Граница35 чувствительности 0,02 мкмоль,Целью изобретения является созданиевысОкочувствительного и быстрого способаопрЕделения активности глутатионтрансферазы, не требующего сложной оптической40 аппаратуры и большого количества участвующих в определении реактивов.Поставленная цель достигается тем, чтов способе определения активности глутатионтрансферазы, заключающемся в прямом45 фотометрическом определении продуктаферментативной реакции глутатиона и второго субстрата, в качестве второго субстрата используется согласно изобретениюнатриевая соль 7-гидрокси-ЗН-феноксаэин- .50 З-ОН-оксида(резазурина), далее именуемая резазурин-йа. Резазурин-йа вприсутствии восстановленного глутатионаподвергается й-деоксигенированию, катализируемому глутатионтрансферазой55 оЙСпособ состоит в приготовлении реакционной смеси, содержащей 0,1 М фосфатный буфер, 1 мМ глутатион и ферментный .препарат. Реакция инициируется добавкой 10 М раствора резазурин-Ка, Сразу вслед 5 за этим измеряется увеличение поглощения при длине волны 573 нм или уменьшение оптического поглощения при длине волны 598 нм, В данной области длин волн возможно применение стеклянной оптики и на иболее простого фотометрического прибора - фотоэлектроколориметра (ФЭ К), Способ позволяет вести кинетические наблюдения за ходом реакции.Используемые реагенты; фосфатный бу фер, 0,5 М, рН 7,5; 10 мМ раствор восстановленного глутатиона в дистиллированной воде; 10 М раствор резазурин-Иа в 0,01 М фосфатном буфере, рН 7,5; ферментный препарат, 20Преимущества предлагаемого способа заключаются в большей чувствительности, чем у прототипа, из-за более высокого молярного коэффициента экстинкции продукта реакции (Епз = 30000) и самого субстрата 25 (%98 = 57150) по данным наших измерений, против 9600 у прототипа. Обнаруживается изменение концентрации на 10 М субстрата (резазурин-Ка) и на 5 10 М продукта;возможности использования стеклянной 30 оптики; возможности измерения на двух длинах волн (двух пиках поглощения), что позволяет ввести в эксперимент контроль устойчивости продукта реакции при работе с полиферментными системами или с неочи щенными экстрактами тканей, что расширяет границы его применения; возможности использования воды в качестве растворителя второго субстрата глутатионтрансферазы, 40Отличительной особенностью данного изобретения является использование резазурин-Иа в качестве субстрата для определения активности глутатионтрансферазы фотометрическим методом. Измерения про водят при длине волны 573 нм или 598 нм с использованием стеклянной оптики. Измерения возможны в интервале рН от 6,0 до 9,0, но предпочтительной областью является 7,5. 50ФСпособ применения предлагаемого изобретения заключается в следующем.Субстрат вносится в реакционную смесь,содержащую буферный раствор, восстанов ленный глутатион и ферментный препарат, сразу после чего проводят измерения оптического поглощения при длине волны 573 нм или 598 нм в течение 3 мин с интервалом 30 с, Полученные данные используют для расчета активности глутатионтрансферазы.Резазурин-Иа производится в СССР в промышленных масштабах, дещев и легко доступен. Реакция ферментативного К-деоксигенирования, катализируемая глутатионтрансферазой, в литературе не описана, поэтому предлагаемый способ является принципиально новым.На чертеже показано изменение спектра поглощения реакционной смеси в ходе реакции, дает наглядное представление о возможности измерения скорости реакции как при длине волны 573 нм, так и при длине волны 598 нм,П р и м е р 1, Иллюстрирует методику измерения активности глутатионтрансферазы в оптимальных условиях.Готовят растворы следующих реагентов; К/Ка фосфатный буфер, 0,5 М, рН 7.5;10 мМ ВодныЙ раствор ВосстаноВленного глутатиона; 0,035 мМ раствор резазурин-Ка в 0,01 М К/йа фосфатном буфере, рН 7,5; цитозольная фракция печени крысы, 1:9, диализированная против 0,01 М К/Ка фосфатного буфера, рН 6,7(ферментный препарат).Составляют пробу общим обьемом 3 мл, содержащую 1,3 мл дистиллированной воды, 0,6 мл буфера, 0,3 мл раствора глутатиона, 0,5 мл ферментного препарата. В пробу вносят 0,3 мл раствора резазурин-йа, смесь перемешивают, после чего немедленно измеряют оптическое поглощение при 573 нм (увеличение поглощения) или 598 нм(уменьшение поглощения). Показания ФЭ К снимают в течение 3 мин с интервалом 30 с,Составляют контрольную пробу, содержащую 1,8 мл дистиллированной воды, 0,6 мл буфера, 0,3 мл раствора глутатиона. В пробу вносят 0,3 мл раствора резазурин-Иа и проводят те же измерения, что и с опытной пробой. Разницу в показаниях между опытной и контрольной пробами (в пересчете на 1 мин) для измерений при длине волны 573 нм используют для вычисления ферментативной активности по формулеЬ Е 573Чпр1000 -1, -1,(мкмоль мин .мгЕ 57 Зар где ЬЕ 57 з - разница в поглощении при 573 нм между опытом и контролем;Чпр - объем пробы, мл;е 573 - молярныЙ коэффициент экстинкции продукта реакции на волне 573 нм;тр - количество белка в пробе, мг.В результате измерений были полученыследующие данные:1759874 1,50,0670,039 20,0880,052 00,0010,000 0,50,0240,017 10,0460,027 время, мин Е 573 опытЕ 573, конт оль 1 мин получаю пересче 0,121 - 0,075 0 0573 -3 0,0 015 3- 5Висучить, 98 нм ата. В ферх - х;) 25 35 40 45 Активность фермента печени крыс тар в опытах составила 0,50 нмоль,минТакой же результат можно пол проводя измерения при длине волны 5 по уменьшению концентрации субстр этом случае вычисление активности мента проводят по формуле- ЛЕ 598Члр1000А - Р, мкмоль мин мг П 1где ЬЕ 598 - разница в поглощении при 598нм между опытом и контролем;%98 - молярный коэффициент экстинкции резазурин-йа при 598 нм;Чпр - объем пробы, мл;п 1 р - количество белка в йРобе, мг,П р и м е р 2. Показывает влияние рНсреды на результаты измерения оптическойплотности,Готовят растворы резазурин-йа в концентрации 3,5 10 М в 0,1 М буфернытворах с различными значениямИзмеряют оптическую плотность рас рпри длине волны 598 нм,рН 3.4 4,5 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 9,0Е 598 0,03 0,08 0,15 0,18 0,18 0,18 0,18 0,19Видно, что при значениях рН 6,0 и вышеоптическое поглощение резазурин-йа остается постоянным. Практические измеренияскорости реакции возможны при рН выше5,5, однако оптимальное значение рН 7,5,так как, с одной стороны, при этом наблюдается минимальная скорость спонтаннойреакции глутатиона с резаэурин-йа, с другой - наиболее высокая скорость ферментативной реакции,Вычисленное значение молярного коффициента экстинкции резазурин-йа соавляет 57150. П р и м е р 3, Определение нижнегопредела чувствительнссти предлагаемогоспособа определения активности глутатионтрансферазы,5 Нижний предел чувствительности определен по методу трех о;Готовят пробу общим объемом 3 мл, содержащую 1,6 мл дистиллированной воды,0,6 мл 0,5 М К/йа фосфатногг, буфера, рН10 7,5, 0,5 мл ферментного препарата и 0,3 мл3,5 10 М раствора резазурин-Ма, Готовятпробу, содержащую те же компоненты, заисключением резазурин-йа, против которойведут измеренИя оптической плотности при15 длине волны 598 нм, Полученные значения,0,185, 0,183, 0,185, 0,185, 0,184. Затем поформуле определяют величину трех дисперсий в единицах оптического поглощения. Поделив это значение 3 0= 2,68 10 на величину молярного коэффициента экстинкции (57150), получают нижний предел чувствительности метода 4,7 10 8 М,Формула изобретения Способ определения активности глутатионтрансферазы, предусматривающий приготовление реакционной смеси, содержащей фосфатный буфер, восстановленный глутатион и исследуемый ферментный препарат, добавление к полученной смеси инициатора реакции и измерение оптического поглощения фотометрическим методом с последующей оценкой активности, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения чувствительности способа, в качестве инициатора реакции используют натриевую соль 7-гидрокси-ЗН-феноксазин-ОН- оксида, измерение проводят на фотоэлектроколориметре, при этом измеряют интенсивность поглощения продукта реакции при длине волны 573 нм или инициатора реакции при 598 нм, а оценку активности ведут по увеличению интенсивности поглощения продукта реакции или по уменьшению интенсивности поглощения инициатора реакции в сравнении с контролем.1759874 0,3 0,3 525 О плсчета (чци 315 с пос я зппуст рчервз,7 оииюрая 6 га ез Уюю рру,7 ртию,Стуловский гентал Корректор И.Шмакова оставителехред М,М Реда лкова оизводственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгоро гарина, 10 Заказ 3155 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ С 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5