Способ обнаружения энтеробактерий в воде

) 5 6 01 М ЗЗУ 18 ГОСУДАРСТВЕ ННЫИ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИПРИ ГКНТ СССР порглн йИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ к микробиолом обнаружения рованной воде, ренного обнару- жидкостях по их соли тетразолизобретение относитс в частности к способ обактерий в регенери звестны способы уско я микроорганизмов в бности редуцировать тели энтероги эн жени спос ев,сле ма 0,001-0,0 К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(71) Кишиневский медицинский институт(54) СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ В ВОДЕ Наиболее близким по технической сущности является способ обнаружения кишечных палочек с помощью индикаторных бумажек, пропитанных питательной средой, содержащей мясо-пептонный бульон, лактозу, агар и ТТХ.Недостатком известного способа является длительность обнаружения кишечных палочек (24 - 48 ч), а такм е его недостаточная чувствительность, Это связано с тем, что в состав среды внесен ТТХ, который при росте оказывает угнетающее действие на рост и размножение микроорганизмов,Кроме того, способ индикаторных бумажек позволяет обнаружить только кишечные палочки, тогда как в воде могут(57) Изобретение относится к микробиологии, в частности к способам обнаружения энтеробактерий в регененированной воде, Цель изобретения - ускорение и повышение точности определения. Отобранную пробу воды вносят во флакон с питатгльной средой в виде пленки, содержащей сухой питательный бульон, углевод и индикатор, с последующей инкубацией и обнаружением энтеробактерий по их способности восстанавливать индикатор.5 табл. находиться и другие представибактерий,Цель изобретения - ускорение и повышение точности определения энтеробактерий в регенерированной воде.Поставленная цель достигается тем, что способ осуществляют путем посева отобранной пробы воды во флакон с питательной средой в виде пленки, содержащей сухой питательный бульон, углевод и индикатор, с последующей инкубацией и обнаружением энтеробактерий по их способности восстанавливать индикатор, При этом в сухой питательный бульон дополнительно введены нитрат натрия или калия двухзамещенный, фосфорнокислый натрий, глицерин и дистиллированная вода придующем соотношении ингредиентов в с%Сухой питательныйбульон 0,014-0,016; нитрат натрия иликалия 1;10 20 25 30 35 40 45 50 55 Двухзамещенныйфосфорнокислыйнатрий 0,0025-0,0035, Глицерин О,СО 15 - 0,0025; Вода дистиллированная Остальное, В качестве индикатора используют рэстеор, содержащий реактив Грисса, цинковую пыль и ледяную уксусную кислоту в соотношениях 1,0:0,001:0,25 на 10 мл дистиллированной воды.Включенный в состав питательно-субстратной пленки нитрат натрия (калия) используют в качестве субстрата, который редуцируется абсолютно всеми энтеробэктериями в нитрит натрия (калия) и определяется с помощью индикатора на нитриты по хромогенной реакции. Двухзамещенный фосфорнокислый натрий создает оптимальный рН 7,2 - 7,4 для роста и размножения энтеробактерий при растворении питательно-субстратной пленки в пробе регенерированной воды, которая имеет рН 6,4 - б,б, Глицерин совместно с бульоном в сочетании с нитратом натрия (калия) служат питательной основой для энтеробактерий, которая способствует их оптимальному росту и быстрому размножению (табл.1). Кроме того, глицерин совместно с питательным бульоном создает условия для образования пленки и фиксации ее на дне флакона, что способствует сохранности ее питательных качеств и стерильности (табл.2),Для обнаружения нитритов используется индикатор, содержащий реактив Грисса, цинковую пыль и ледяную уксусную кислоту в соотношениях 1,0:0,001;0,25 на 10 мл дистиллированной воды, который является наиболее чувствительным (табл.З).Все это позволяет повысить чувствительность и ускорить обнаружение энтеробактерий до б - 4 ч при концентрациях , 104 - 10 и до 9 ч при концентрациях до 1 - 10 микробных клеток в 1 мл (табл,4).Способ осуществляют следующим образом,1, Приготовление питательно-субстратной пленки. Навеску сухого питательного бульона растворяют в дистиллированной воде, добавляют нитрат натрия (калия), двухзамещенный фосфорнокислыйнатрий и подогревают, Затем полученный раствор питательной основы фильтруют через бумажный фильтр, добавляют глицерин и вносят во флаконы, Затем воду выпаривают, получая питательно-субстратную пленку, фиксированную на дне флакона, Флаконы с пленками закрывают и стерилизуют.2. Приготовление индикатора нэ нитриты. Навеску сухого реактива Грисса растворяют в дистиллированной воде, добавляют ледяную уксусную кислоту и цинковую пыль. Полученный раствор фильтруют и хранят в холодильнике,3. Обнаружение энтеробактерий. Испытуемую и робу регенерирован ной воды в стерильных условиях вносят во флакон с питательно-субстратной пленкой, инкубируют при 37 С, Для обнаружения нитритов смешивают каплю среды иэ флакона с индикатором на нитриты и определяют их поизменению цвета, что свидетельствует о наличии в воде энтеробактерий. П р и м е р 1. Методика приготовления питательно-субстрэтной пленки, Навеску питательного сухого бульона в 15 г тщательно размешивают в колбе со 100 мл холодной дистиллированной воды. Кипятят на медленном огне 1 - 2 мин, постоянно помешивая, В полученный раствор вносят 2 г нитрата натрия (калия) и 3 г двухзэмещен ного фосфорнокислого натрия, постоянно перемешивая до полного растворения. Затем полученный раствор дважды фильтруют через двойной бумажный фильтр, после чего добавляют 2 мл глицерина. Питательная основа имеет вид жидкости темно-коричневого цвета. Далее пипеткой-дозатором переносят по 0,2 мл жидкой питательно-субстратной основы в химически чистые сухие флаконы емкостью 10 мл. Для получения питательно-субстратных пленок выпаривают жидкую часть путем помещения флаконов под струю нагретого до 60 С воздушного потока на 1 ч. После получения пленок светло-коричневого цвета флаконы закры ва ют стерил ьн ыми рези новы ми и робками и стерилизуют.Флаконы с питательно-субстратными пленками хранят при +4 - 7 С в условиях холодильника и используют для ускоренного обнаружения энтеробактерий в регенерированной воде.2, Методика приготовления индикатора на нитриты, В фарфоровую ступку вносят 1 г ,сухого реактива Грисса и тщательно его гомогениэируют пестиком до получения мелкодисперсной пудры, затем приливают 10 мл дистиллированной воды, постоянно перемешивая до полного растворения реактива. После чего раствор переносят в бактериологическую пробирку, к нему приливают 0,25 мл ледяной уксусной кислоты и вносят 0,01 г цинковой пыли, Полученный индикатор фильтруют и хранят в пробирке с плотно закрытой пробкой в холодильнике пыли в темном месте при комнатной температуре,3. Обнаружение энтеробактерий в регенерированной воде. Для этого используют питательно-субстратные пленки во флако1700468 0,001 - 0,010 Таблица Влияние ингредиентов питательно-субстратной пленки на рост и размножениеэчтеробактерий Ингредиенты,входящие в состав питательно-субстратной пленки в пределах граничных значений и результаты обнаружения эна- робактерий Игп/и Варианты состава питательно-субстратной пленки 2 3 4 5 1. Сухой питательный агар2, Нитрат натрия (калия) 3 Двухзаиещенный Оосоорнокиспый натрий 4. Глицерин 5. Концентрация энтеробактерий в 1 нл через 9 ч инкубации6, Обнаружение энтеробактерий в 1 через 9 ч инкубации нл обна руже. П р и и е ч а н и е. Вода дпя посева содержала 1-10 микробных клеток в 1 ил. нах, приготовленные из ингредиентов в пределах указанных граничных значений (табл.5). Все примеры состава реагента, приведенные в табл.5, выполняют аналогично.Исследуемую регенерированную воду забирают стерильным шприцем в объеме 1 мл и вносят во флакон с питательно-субстратной пленкой путем прокола резиновой пробки иглой шприца. После легкого встряхивания для полного растворения и равномерного распределения питательной основы, флаконы направляют в термостат при 37 С. Регистрацию результатов проводят через 6 и 9 ч инкубации. Для этого с помощью шприца забирают 0,1 мл индикатора на нитриты и вносят во флакон путем прокола резиновой пробки иглой шприца. При положительной реакции на нитриты происходит окрашивание содержимого флакона в течение 1 мин в вишнево-красный цвет, а при отрицательной - остается первоначальный цвет (соломенно-желтый). При положительной реакции через 6 ч в 1 мл регенерированной воды до подращивания содержится 105 - 10 микробных клеток в 1 мл, а при положительной реакции через 9 ч - 1 - 100 клеток в 1 мл.Предлагаемый способ является более быстрым и позволяет повысить чувствительность обнаружения энтеробактерий при наличии единичных микробных клеток в 1 мл регенерированной воды. Формула изобретения Способ обнаружения энтеробактерий вводе, предусматривающий посев отобран ной пробы воды в питательную среду, содержащую сухой питательны 0 бульон, углевод и индикатор, последующую инкубацию и регистрацию энтеробактерий по их способности восстанавливать индикатор, 10 о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с цельюускорения и повышения точности определения, в сухой питательный бульон дополнительно введены нитрат натрия или калия, двухзамещенный фосфорнокислый натрий, 15 и глицерин и дистиллированная вода приэтом ингредиенты взяты в следующем соотношении, мас. : Сухой питательный20 бульон 0,014 - 0,016Нитрат натрия иликалияДвухзамещенныйфосфорнокислый25 натрий 0,0025 - 0,0035Глицерин 0,0015 - 0,0025Вода дистиллированная Остальное,а в качестве индикатора используют рас 30 твор, содержащий реактив Грисса, цинковую пыль и ледяную уксусную кислоту всоотношениях 1,0:0,001;0,25 на 10 мл дистиллированной воды,1700468 Т а б л и ц а 2Сохранность питательных качеств и стерильностипитательно"субстратной пленкиттт т вВремя обнаружения энтеробактерий при кон- Ч"Г " Х )1 Г"-Интервалнаблюдений Таблицвз Чувствительность и скорость определения энтеробактерий е зависимости от колицественных соотношений ингредиентов индикатора на нитритыЛедяная Результаты обнаружения энтеробактерий и ихуксусная концентрации в 1 мл регенерированной воды: - ..1." 1 ".:.10,23 0,23 С С С С С С025 025 РП РП вП РП РП РП РП0,27 0,27 С С С С С С С. 0,28 0,28 С С Н при- нера Реактив Грисса Цинкбаая пыль абс 1. 0,07 0,07 2, 0,08 0,08 3, 1 О 101,2 1,2 1,З 1,З 0007 0,007 О 008 О 008 0,001 0,001 0,012 0,012 0,013 0,013 П р и и е ц а н и е. Регистрация результатов обнаружения энтеробактерий проводилась через 9 ч инкубации при 37 С- реакция отрицательная; нСи - реакция сомнительная;иРПн - реакция резко положительная,1 аблица 4 Скорость и чувствительность обнаружения энтеробактерий предлагаемын и известнын способом Энтеробактерии Концентрация энтеробактерий в 1 мл воды Нпlп Известным способом 10 и до 1 О 104 100 до1. ЕпсетоЬассег 2982. ЕпсетоЬассет 4473 С 1 стоЬассет 204. СЕстоЬассет 1175. Е. со 11 0886. Р.цц 1 еат 1 в 9697. Р,ш 1 теЬ 1111 в 2348, Ргот 1 Оепс 1 а 93/549. З.вт 1 зопае 16159+ + П р и м е ч е н и е, 0 предлагаемом способе энтеробактерии в концентрациях 10 "О обнару"4 4ввались через 6-4 ц, а в концентрациях 1-100 - через 9 ч инкубациипри 37 С.0 известном способе обнаруживались только Е.со 11 в концентрациях 10н более при инкубации в тецение 24 ч,. 1 месяц3 месяца6 месяцев 1 год1 год бмесяцев2 года%тО. Ото хО КБ хО Б1- Бл аЭ10)9 3а 3 О Э л о а а с Я Б а Э 0 О 1- т Э Х а Э а