Способ определения l-лизина

ОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИН ТЕН ЕТЕЛЬСТВУ о 18 Ьу, Х. оГ 1980. ИВА аналианали инеиий н чистки и так и ии. 3 табл.ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИИ АНИЕ ИЗ К АВТОРСКОМУ(56) 11 атент США Иф 4234691,кл. С 12 М 9/06, 1980.Т.ИаКагаиа, К.Ног 1, О.НауаБСодеа оп Иопоохуеепааев Ч.Во 1. СЬев., 247 3439-3444,(54), СПОСОБ. ОПРЕДЕЛЕНИЯ Ь-ЛИЗ(57) Изобретение. относится ктической биохимии, а именно кзу биологически активных соед Р 13/08, С 12 Я 1/26 с помощью ферментов. Целью изобрете ния является повышение точности опр деления. Способ заключается в том, что при определении Ь-лиэина производят его окисление Ь-лизин-моно;.аксигеназой продуцируемой штаммом Рееидовопаа рцсЫа ВКМ В. При , этом по йзменению концентрации кисл рода судят о количестве лизина. Изм рение концентрации кислорода проводят, например, мембранным кислородным электродом. Используемый ферме может быть любой степени оиспользован как в растворер иммобилиэованном состоянИзобретение относится к аналитической биохимии, а именно к анализу биологически активных соединений с . помощью ферментов, 5Целью изобретения является повышение точности определений.Способ заключается в том, что при определении Ь-лизин окиспяется Ь-лизин-А.оксигеназой из Рзеидопопав рц СЫа ВКИ В.При этом контроль ведут регистра-, цией убыли концентрации кислорода при ферментативной реакции окисления Ь-лизина ферментом Ь-лизин-моно оксигеназой., Измерение концентрации кислорода .проводят, например, мембранным .кислородным электродом Используемый фермент может быть любой степени 20 очистки, поскольку даже в клеточном гомогенате не содержатся ни другие оксидазы аминокислот, ни ингибиторы Ь-лизин-монооксигеназы.Процесс определения Ь-лизина про водят следующим образом. В герметичную, термостатируемую ячейку заливают буфер и перемешивают магнитной мешалкой." Ячейка снабжена кислород-, ным электродом. Оптимальный объем, ЭО ячейки 3-10 мл, Большие объемы при-., Йодят к увеличению траты как фермента, так и анализируемого раствора, а слишком маленький объем ячейки снижает точность определения. В ячейку добавляют 0,05 мл ферментного раствора любой степени очистки или клеточный гомогенат, содержащий 1-8 МЕ Ферментативной активности. После установления тока кислородного электрода в ячейку вводят 0,1 мл образца и регистрируют скорость потребления кислорода. На основе известных кон.центраций строится калибровочная кривая, с помощью которой определяют концентрацию Ь-лизина в пробе.При использовании иммобйлизованно-,го фермента его помещают в проточный реактор, через который с постояннойскоростью прокачивают буферный раствор. Скорость протока подбирается экспериментально, исходя из параметров колонки. На выходе колонки устанавливают кислородный электрод и ре-. гистрируют ток электрода. В проток " вводят 0,05 мл анализируемого раствора и регистрируют максимальное зна.чение амплитуды сигнала или его производной. На основе кривой, получен Относительная активность, ХОпределяемая аминокислота ферментпосле Грубыйкле- точный ферментпослехроматографиина сеф.ДЭАЭ Асульфатногоосажэкстракт дения 1-лизин 100 100100 с 1 1 Ь-орнитин 0 О Ь-аргинин Ь-/3-фенилЫ,-алании 0 0 0 0 - 0 О, 0 1-гистидии Ь-глутамин 0 0 Ь-аспарагин ной с помощью известных концентраций,определяют содержание Ь-лизина впробе.П р и м е р 1 Для определенияконцентрации Ь-лизина в термостатируемую ячейку объемом 5 .мл, содержащую 0,05 М глицин-ОН-буфера .рН 9,0,при 25 С вводят 0,05 мл ферментногораствора любой степени очистки, содержащего 3,5 ИЕ каталитической. активности. Концентрацию кислорода вячейке определяют с помощью мембранного кислородного электрода, содержимое ячейки перемешивают с помощьюмагнитной мешалки.После установления тока электродав ячейку вводят О, 1 мл раствора .Ь-лизина и регистрируют скорость потребления кислорода,Н р и м е .р 2. Определение прово-,дят, как в примере 1. В ячейку вводят ферментный препарат различнойстепени очистки, после установлейиятока кислородного электрода в ячейкувводят 0,1 мл раствора различных аминокислот при концентрации 20 мМ.В табл. 1 приведены данные опреде,ления субстратной специфичности Ь-лизин-монооксигеназы на разных стадиях очистки фермента.Таблица.1.66, 3 8,0 8,8 78,3 93,7 Концентрация Ь-лизина, мМ Величина сигнала, 30 кислородного электрода, мкА 100,0 10,0 96,1 10,5 90,4Определение концентрации Ь-лизина можно проводить в широком дипазо не рН.П р и м е р 5. Иммобилизованный препарат готовят, как в примере 3. .Через реактор прокачивают 0,05 И. глн-. цин-ОН-буфер, рН от 8,5 до 10,5. Концентрация Ь"лизина в растворе 11 мИ, объем вводимой пробы 0,05 мп.Влияние рН буфера на активность иикобилизованного фермента: рЦ буфераОтносительная активность, Х 5,5 0,3 35 1, 13 11,0 16,5 2,0 40 2,63 22,0 83,2 8,5 9,0 100,09,5 .82,3мОптимальное значение .рН равно 9,0.Однако, поскольку при рН 8,5 и,9,5активность иммобилиэованного ферментного препарата остается на достаточП р и м е р 3. К 500 мг силиквгеля . (средний размер пор 200 А, удельная поверхность 280 мф/г, Фракция 0,6" 0,4 мм) предварительно модифицирован ного 3-амннопропилтриэтохсисиланом и активированного глутаровым диальдегидом, приливают 4 мл раствора Ь-лизин-монооксигенаэы в 0,05 И калийфосфатном буфере рН 8,0, Содержащего 10 32 МЕ каталитической активности, и инкубируют на качалке при комнатной температуре в течение 2,5 ч.Иммобилизованньм препаратом заполняют проточный реактор длиной 110 мм 15 и внутренним диаметром 4 мм, снабжен- ньвЪ кислородным электродом, и регистрируют изменение содержания кислорода в протоке 0,05 И глицин-ОН буфера рН 9,0, происходящее вследствие фер ментативного окисления введенного в проток Ь-лизина. Скорость протока равна 3,5 мл/мин, Объем вводимой пробы 0,05 мл.Определение концентрации Ь-лизина 25 в растворах с помощью иммобилизованного Ферментного препарата: Таким образом, зависимость величи. ны сигнала от концентрации Ь-лизина описывается корреляционной прямой 45 =(О, 143+0,006)х+(-0,45+0,095) с коэффициентом корреляции 0,994, следовательно, в области концентраций . 5,5 - 22 мИ величина сигнала находится в линейнойзависимости от концент 50 рации Ь-лизина.При концентрациях выше 22 мИ определение можно проводить, разбавляя исследуемый образец до тех значенийконцентраций, которые окажутся в линейном диапазоне определения. При концентрации лизина в образце ниже 5,5 мИ точное определение можно проводить с помощью метода добавок, Дпя этого, прибавляя к исследуемой пробе строго определенные количества кристаллического лизина, добиваются таких значений величины сигнала кислородного электрода, которые находятся в пределах линейного диапазона. Зная количество добавляемого лизина, легко можно рассчитать истинную ковцент. рацию в исследуемой пробе.П р и м е р 4, Определение проводят, как в примере 1, В ячейку заливают 0,05 М глицин-ОН буфер с разны, ми уН После установления тока элект" рода в ячейку вводят О, 1, мм 50 мИ раствора Ь-лйзина.Влияние рН буфера на активность нативного ферментного препарата: рН буфераОтносительная активность, Х1387417 Номер пробы культуральной жидкости Базовый(электрофорез набумаге) Предла- Газожндгаемьй костная способ хромато- графия Определяемая аминокислота:1 Предлагаемый способ Прототип 16,5 17,5 20,0 25 2 16,5 18,2 22,5 100 100 Ь-лизин 16,0 17,0 23,7 Ь-орнитин 30 0 Ь-арфинин 26 ф 0 28 ю 6 29,4 ЬфенилА-алании 26,5 12,0 28,0 15,2 6 35. 728,5 12,8 0 0 Не опреде.лено Ь-гистидин Ь-глут аминЬ-аспар агин 0 кислородного электрода, мкА 1,33 1,20 10,20-50 1,13 1,05 60 но высоком уровне, определение концентрации Ь"лизина возможно во всем укаэанном диапазоне рН при условии сохранения данного значения рН (что обеспечивается высокой буферной емкостью раствора) в ходе определения.П р и м е р 6. Иммобилизованный фермейтный препарат готовят, как в примере 3. В проток вводят 0,05 мл 10 раствора соответствующей Ь-аминокислоты с концентрацией 11 мМ, регистрируют максимальное значение амплитуды сигнала кислородного электрода.В табл. 2 дана субстратная специфичность иммобилизованной Ь-лизин- монооксигеназы к. различным аминокислотам. Т а б л и ц а 20 Относительная активность, Х Предлагаемый способ определения обладает более высокой по сравнению 45 с прототипом избирательностью по отношению к Ь-лизину и может успешно применяться при определении Ь-лизина в сложных многокомпонентных раство- рах, в том числе в смесях амино кислот Предлагаемый способ позволяет пс крайней мере на порядок уменьшить ошибку, вызванную окислением других аминокислот. Это важно, например для успешного слежения эа ходом ферментации прн промьпнленном производстве Ь-лизина. П р и м е р 7. Иммобилиэованныйферментный препарат готовят, как в примере 3. В проток колонки вводят 0,05 мл разбавленной в 10 раэ культу- ральной жидкости, полученной при микробиологическом производстве Ь-лизина. На основе калибровочной кривой, полученной с помощью модельных растворов Ь-лизина, определяютконцентрацию Ь-лизина в культуральной жид" костиВ табл. 3 приведены данные определения концентрации Ьлиэина в культуральной жидКости разными методамиТаблица 3 Концентрация Ь-лизина, г/л 20,5 22,4 22,8 П ри м е р 8. Иммобилиэованный ферментный .препарат готовят, как впримере 3.Стабильность иммобилизованной Ь-лизин-монооксигеназы во времени при концентрации лизина 1 мИ, в протоке 0,05 М глицин-ОН-буфер рН 9,0, 25 С:Количество дней Величина сигналаработы1387417 Формула изобретения Составитель В.ВарламовРедактор Л,Волкова Техред А.Кравчук Корректор В.Гирняк Тираж 48 1 . . ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж Раушская наб., д. 4/5Заказ 3091 Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4" Иммобилиэованный феоментный препарат эа два месяца работы теряет не более ЭОУ исходной активности.П р и м е р 9. Реализация предложенного способа определения Ь-лизина.Предложенный способ реализован в виде устройства, представляющего . собой проточный реактор с иммобили-1 О зованным ферментом Ь-лизин-монооксигеназа из Рвеидошопав ройЗа ВКМ В, На выходе реактора установлена камера детектирования с кислородным электродом. 15Конструкция камеры детектирования .позволяет осуществлять равномерную подачу раствора к кислородному электроду. Устройство ввода образца позволяет вводить в проток буферного раст вора точно дозированные количества анализируемого образца. Электронный блок обеспечивает стабилизированноепитание кислородного электрода, дает возможность определять как максималь ное значение амплитуды сигнала кис- "лородного электрода, так и проиэводной сигнала, обеспечено запоминаниемаксимальной амплитуды сигнала кислородного электрода. Осуществленастыковка устройства с микроЭВМ, чтопозволяет производить. автоматическуюобработку информации,Способ определения Ь-лизина, включаюший взаимодействие анализируемого образца, содержащего Ь-лизин, с лиэинокисляющнм ферментом в буферном растворе с последующей регистрацией изменения концентрации кислорода и установлением по его величине количества лизина, о т л и ч а ю щ и Й - с я тем, что, с целью повышения точности определения, в качестве лизинокисляющего фермента используют Ь-ли зин-монооксигеназу, нродуцируемую Рвепдошопав. риСИа,ВКМ В.