Способ предотвращения микробного разложения углеводных полимеров растительного происхождения в почвенных образцах

(511 4 С 12 М 1/О ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТК А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ(56) Хранение пищевых продуктов икормов с применением консернантов.Кишинев, 1982, 175 в 1,(54) СПОСОБ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ МИКРОБНОГО РАЗЛОЖЕНИЯ УГЛЕВОДНЫХ ПОЛИМЕРОВРАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ В ПОЧВЕННЫХ ОБРАЗЦАХ(57) Изобретение относится к областипочвоведения и сельского хозяйства,Целью изобретения является предотвращение загрязнения окружающей средыза счет исключения использования токсичньх реагентов. Способ заключаетсяв следующем. Гбтовят образец почвы,увлажняют его и вносят глюкозу в кон 801 42 2 А 1 центрации 1,0-3,0 мг/г почвы, инкубируют образец в течение недели и затеконтролируют степень воздействия глюкозы. Об интенсивности разложениярастительных материалов судят поуменьшению длины грибного мицелия,развинающегося на 7 сут на внесенном полимере - крахмале или целлофане, и по отсутствию зон гидролизакрахмала или целлофана, обнаружинаемых на 7 сут разложения с помощьюсканирующего электронного микроскопаа также по уменьшению в скорости выделения двуокиси углерода при разложении крахмала или целлофана. Длительность действия глюкозы в почверегулируют высушиванием с последующим увлажнением. По данному способудостигается строгая селективностьпредотвращение разложения растительных остатков только микроорганизмамииэ группы гидролитиков.113429Изобретение относится к почвоведению и сельскому хозяйству.Цель изобретения - предотвращение загрязнения окружающей среды за счеть исключения использования токсичныххимических реагентов.Способ осуществляют следующим образом.Отбирают почвенный образец. Для предотвращения микробного разложения углеводных полимерон растительного происхождения в образце почвы производят следующие операции, включающие предварительную подготовку образца, 1 г, собственно предотвращение микробного разложения углеводных полимеров н образце и контроль за предотвращением разложения.Преднарительная подготовка образца 20 нключает увлажнение воздушно-сухой почвы до полевой влагоемкости и инкубирование его во нлажной камере при 25 С в течение недели. В случае исопользования естественно увлажненного 5 образца такая предварительная подготовка не требуется.предотвращение микробного разложения углеводных полимеров растительного происхождения в образце достигают ЗО внесением в почву глюкозы н количестве 1,0-3,0 мг/г почвы. Глюкозу вносят в виде водного раствора, почву тщательно перемешивают и инкубируютово влажной камере при 25 С неделю. Процесс утилизации глюкозы в почве сопровождается снижением гидролитической активности почвенных микроорганизмов-гидролитиков. Достигнутый уровень снижения сохраняется н почве 40 не менее месяца, в течение этого периода происходит предотвращение раз- ложения угленодцых по имеров микроорганизмами.Контроль за предотвращением мик робного разложения углеводцых полимеров в почве осуществляют путем измерения длины грибного мицелия, развивающегося ца внесенном н почву полимере растительного происхождения. Для этого из образцов почвы, предицкубированных с глюкозой и без цее, готовят почвенные пластинки в чашках Петри диаметром 4 см, заполняя их полностью и получая ровную поверхность. На поверхность почвенных пластинок наносят полимер (крахмал или целлофан) н количестве не более 5 мг/г почвы. Почну ицкубируют во влажной 22 2камере при 25 С неделю. Затем измеряют длину грибного мицелия в микробном сообществе, развивающемся на внесенцом полимере, с помощью светового микроскопа в отраженном свете при увеличении 1 ООх, Кроме того, с помощью сканирующего электронного микроскопа следят за образованием зон гидролиза крахмала или целлофана и производят измерение скорости вьщеления двуокиси углерода при разложении крахмала или целлоФана на газовом хроматографе. Уменьшение длины грибного мицелия на полимере в почне после внесения глюкозы по сравнению с вариантом без внесения глюкозы, отсутствие зоц гидролиза на полимере и уменьшение скорости ньщечеция двуокиси углерода при разложении полимера свидетельствуют о предотвращении разложения.В результате деятельности микроорганизмов-гндролитиков в почве происходит синтез экзогидролаэ, которые обеспечивают синхронное расщепление растительных угленодных полимеров и снабжение микробной клетки мономерами - источниками углерода и энергии, Интенсивность роста микроорганизмовгидролитиков находится н прямой связи с синтезом ими экзогидролаэ. На этом основании представляется возможным по длине мицелия микроорганизмовгидролитиков судить об уровне их гидролитической активности в почве и об интенсивности разложения ими растительных углеводов. Прямые наблюдения за гидролизом полимеров в сканирующем электронном микроскопе, а также слежение за уровнем выделения двуокиси углерода при разложении полимера дополнительно свидетельствуют о изменении гидролитической активности почвецных микроорганизмов, а следовательно, об интенсивности разложения растительных углеводов. Учитывая, что в продукции двуокиси углерода могут участновать и микроорганизмы, не относящиеся к группе гидролитиков, для количественной оценки степени снижения интенсивности разложения растительных полимеров используют отношение величин длин грибного мицелия в вариантах с глюкозой и без нее.Обнаружено явление длительной необратимости репрессии синтеза микроорганизмами гидролитических ферментов. Это проявляется при разовом вне55 сеции н почву небольших количеств глюкозы, Несмотря на то, что глюкоза полностью утилизируется микроорганизмами в течение 2-3 сут после нцесеция в почву, ее последейстние в репрессии синтеза гидролитических ферментов имеет место продолжительггое время и может проявляться даже через месяц и более. Обычно на питательных средах лишь в присутствии мономера проявляется репрессия синтеза гидролитических Ферментов .П р и м е р 1. Г 1 редотвращецие микробного разложения крахмала в типичном черноземе.Образец воздушно-сухого черцозема в количестве 1 кг увлажняют до полевой влагоемкости, для чего вносят 330 мл дистиллированной воды, тщательно перемешивают и ицкубируют вотечение недели при 25 С. Затем почву разделяют на десять равных частей, н которые вносят навески глюкозы 0,1;10 е 01 ЗОБО 50 еО 70 ьО 1000 150 ь 01 200,0,и 300,0 мг, Из каждой части готовят почвенные пластинки в шестикратной повторности. Пластинки инкуо бируют в термостате при 25 С но влаж- ной камере в течение недели. По истечении недели длину мицелия грибов, развившихся на внесенном крахмале, измеряют с помощью светового микроскопа в отраженном свете при увеличении 100 х, В варианте без добавления глюкозы происходит интенсивное заселвние крахмала грибами, В вариантах с внесением глюкозы в интервале концентраций от 0 до 0,5 мг/г почвы длина грибного мицелия остается практи 2 чески неизменной и равна 200 м/см поверхности почвенной пластинки, что свидетельствует о высокой интенсивности разложения крахмала грибами в этих условиях. При увеличении концентрации глюкозы от 0,5 до 1,5 мг/г почвы происходит резкое сокращение длины грибного мицелия до 1-2 м/см т.е. снижение интенсивности разложения крахмала грибами, Таким образом, при концентрации глюкозы 1,5 мг/г почвы достигается максимальное предотвращение разложения полимера почвенными микроорганизмами. Дальнейшее увеличение концентрации глюкозы не приводит к дополнительному снижению интенсивности разложения крахмала.Проводят микроскопическое исследование процесса разложения крахмала в 10 15 20 25 30 35 40 45 50 почве с помопгью скацирующего электронного микроскопа, Гри низких значениях концентрации глюкозы в интервале от 0 до 0,5 мг/г почвы в местах контакта грибных гиф с зернами крахмала обнаруживаются характерные зоны гидролиза, образующиеся за счет действия грибных экзоамилаэ, выделяющихся в среду. В дальнейшем процесс разложения прогрессирует, эоны гидролиза расширяются, образуя характерные борозды и каверны. В вариантах с нцесением глюкозы в концентрациях сньппе1,5 мг/г почвы це происходит гидролиза крахмала в течение месяца наблюдений. П р и м е р 2. Предотвращение разложения целлюлозы микроорганизмамин ньпцелаченном черноземе и дерновоподзолистой почве. Ход анализа аналогичен описанному в примере 1. Рассматривают целлюлозоразрушающую активность почвенных микроорганизмов, поэтому используют целлофан в концентрации 5 мг/г почвы.В вариантах с внесением глюкозы длина грибного мицелия сокращается н обоих почвах при возрастании концентрации глюкозы в интервале от 0,5 до3,0 мг/г почвы. При этом он почтиполностью исчезает с целлофана приконцентрации глюкозы, равной 3 мг/г почвы для чернозема и при 2 мг/г почвы для дерново-подзолистой почвы.Таким образом, значениями концентрации глюкозы, за пределами которыхпроисходит максимальное снижение интенсивности разложения целлюлозы,сопровождающееся полной репрессиейсинтеза экзоцеллюлаз, являются длячернозема 3 мг/г, а для дерново в подзолистой почвы - 2 мг/г почвы, Приэтих значениях концентраций внесенной в почву глюкозы подтверждаетсядостижение положительного эффекта,а именно предотвращение микробногоразложения угленодного полимера растительного происхождения (целлюлозы)путем снижения уровня гидролитической активности микроорганизмов в выщелаченном черноземе и дерново-подзолистой почве н 100 и 80 раз соответственно. Проводят микроскопическое исследование процесса разложения целлофана в почве с помощью сканирующего электронного микроскопа. При низких значениях концентрации глюкозы в интер 5134 вале от 0 до 0,5 мг/г почвы происходит интенсивное заселение целлофана микроскопическими грибами. При этом вокруг грибцьсх гцф обьсаруживается зонд гидролцзд цел:софдцд, образующаяся за счет выделеция грибдми экзоцеллюлаз. В дальнейшем рдзложецие прогрессирует, зоны гидролизд расширяются и происходит полное рдзпожецие целлофана. Через 1 О дней ицкубдции длина грибного мицелця достигает максимальной величины, ндчицдют образовываться репродуктивные органы микромицетов. В вариантах с внесением глюкозы в почву в концентрации выше 3 мг/г для чернозема и 2 мг/г для дерново- подзолистой почвы це происходит гидролиза целлофдцд в течение месяца наблюдений.П р и м е р 3. Предотвращение разложения крахмдлд в ерьсово-ссодзолистои почве.Ход анализа аналогичен описанному в примере 1, Активность в разложении крахмала микроорганизмами в дерново- подзолистой почве характеризуется2.длиной грибного мццелия 150 м/см , д в варианте с внесением глюкозы - 2 м/см . Таким образом, в данномпримере подтверждается достижение положительного эффекта, а именно предотвращение разложения крахмала путем сьсижеьсия уровня гидролитическойактивности микроорганизмов в дерново- подзолистой почве в 75 раз.Изучают кинетику процесса выделения двуокиси углерода, образующегосяв результате разложения крахмала в почве. Определение показало, что скорость продукции двуокиси углерода в варианте без глюкозы больше, начиная с четвертого дця ицкубации, чем в варианте с глюкозой, в 2,8 раза. Таким образом, кинетический анализ кривых дыхания свидетельствует о том, что интенсивность разложения углеводного полимера (крахмала) может быть в значительной степени предотвращена добавлением в почву глюкозы,П р и м е р 4. Обратимость эффекта предотвращения микробного разложения углеводцых полимеров растительного происхождения,С целью снятия действия глюкозы на способность почвенных микроорганизмов к разложению растительных материалов дерново-подзолистую почву29226 5 10 15 20 30 35 40 45 50 55 после цредицкубировдция с глюкозой в концецтрдции 0,6 мг/г почвы подвергают следующим обрдботкам: вакуумировдцию, замораживанию, кратковременному и длительному высушивдцию. Затем образцы почвы вновь увлажняют до полевой влагоемкости, интенсивность разложения углеводных голимеров микроорганизмами определяют по длине грибного мицелия, который развивается ца внесенном в концентрации 5 мг/г почвы крахмале, К наибольшему эффекту приводит длительное высушивание, Длина мицелия грибов в амилолитическом микробном сообществе, подверженном действию длительного высушивания, в 75 раз больше, чем в сообществе почвы без каких-либо дополнительных обработок, т.е, высушцвдние полностью снимает эффект предотвращения микробного разложения углеводных полимеров растительного происхождения под действием глюкозы.Таким образом, положительный эффект достигается путем внесения в почву абсолютно не токсичного для высших организмов и обычного для почвы соединения - глюкозы. Длительность действия глюкозы в почве регулируется простым лабораторным приемом - высушиванием с последующим увлажнением, как показано в примере 4. Это обусловлено обратимостью репрессии синтеза гидролитических ферментов микроорганизмами после высушивания репрессированной почвы. По предлагаемому способу достигается строгая селективность - предотвращается только процесс разложения углеводородных полимеров микроорганизмами-гидролитиками (примеры 1-3). Кроме того, в предлагаемом способе не нарушается структура естественных микробных сообществ почвы, Согласно примерам 1-3 снижение интенсивности разложения при использовании глюкозы происходит в 75-100 раз по оценке длины мицелия грибов-гидролитиков и в 2,8 раза по оценке такого общего показателя биологической активности почв, как продукция двуокиси углерода. При этом степень влияния предлагаемого вещества нд интенсивность разложения эффективнее, чем в известных способах.Формула изобретения Способ предотвращения микробного разложения углеводцых полимеров рас1342922 Составитель Б.БызовТехред И.Попович Корректор Л.Патай Редактор Н.Бобкова Тираж 499 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Заказ 4604/25 Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 тительного происхождения в почвенных образцах, предусматривающий увлажнение образца, внесение в образец полимера и органического вещества-ингибитора роста почвенных микроорганизмов,5 с последующим инкубированием и оценкой полученных результатов, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с целью предотвращения загрязнения среды, вобразец вносят глюкозу в концентрации 1-3 мг/г почвы в качестве ингибитора роста микроорганизмов-гидролитиков, а оценку результатов осуществляют путем измерения длины грибного мицелия, развивающегося на полимере,