Способ определения -токоферола

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК А 1 4 С 01 М 30/О ВИС 11 щ ЕНИЯИЬ 1 ф ОТЫА Н АВТОРСКОМ ИДЕТЕЛЬСТ етически бретения и способ мина Е и слей, Цель одства ви нтиокисли увствительно (-токоферол овышени Способ заленни образмой частиматографиопределения ключается в цов, экстра гексаном, т лочном омь и неомыляе нкослойно роведении цватг ственно на плас омпл етн ометрировании пластинок пров тки раствором асцов, высушив раствором бато едующим элюиро ление обраб ных к элюата, Проя дят путем их железоаммони ния и обрабо ки их енантролина с анно го ф рашенного адсорбиью, содержащей фосерную кислоту и вание ровсфорную метанол компонен- С, та 5-7 слоя смекислоту,ующем соотношени фосфорная. кисл ри след Ов, об, ерная к слота 0,1-0,3, 2 табл,етанол остал СО СЛ:1 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИИ ИСАНИЕ ИЭО(57) Изобретение относится к химическим методам определения -токоферолас применением хроматографических методов очистки, в частности тонкослойной хроматографии (ТСХ), и может бытьиспользовано в сельскохозяйственных,медицинских и фармацевтических лабораториях при определении содержания4-токоферола и синтетических антиокислителей фенольного ряда, а такжесантохина и дилудина в кормах, пищевых продуктах, в органах и тканяхживотных, а также для контроля произЯ 01332223 ческом разделенииной реакции непосртинке, элюированииса с пластинки и фоИзобретение относится к химическим методам определения витаминов группы Е (такоферолав) с применением хроматографических методов очистки, в частности тонкаслойной хроматогр афии (ТСХ) .Способ заключается в том, что проявление пластинок проводят путем их обработки раствором железоаммоний ных квасцов, высушивания и обработки раствором батофенантролина а в качестве элюента используют смесь, состоящую из фосфорной кислоты, серной кислоты и метанола при следующем 15соотношении компонентов, аб,%:фосфорная кислота 5-7Серная кислота 0,1-0,3Метанол О стальноеНаиболее существенными отличительными признаками предлагаемого способа являются следующие1, Проявление пластинок проводятпутем их обработки раствором железа. -аммонийных квасцов, высушивания иобработки раствором батофенантролина,2, В качестве элюента используютсмесь, состоящую иэ фосфорной кислоты, серной кислоты и метанола при 30следующем соотношении компонентов,об.7:Фосфорная кислота 5-7Серная кислота 0,1-0,3Метанол 35Предлагаемый способ позволяетвдвое повысить чувствительность определений и дает возможность определятьсинтетические антиокислители фенольного ряда, сантохин и дилудин, 40Определение витамина Е проводятследующим образом,П р и м е р 1Определение витамина Е в желтке куриных яиц,Навеску желтка куриного яйца 45(0,1-0,2 г) переносятв колбочку дляомыления, добавляют 50 мл этанола,100 мг пирогаллола и 2 г гранулированного едкого натра, присоединяютобратный холодильник и омыляют на 50оглицериновой бане 20 мин при 90-95 С,Затем охлаждают и трижды экстрагируют неомыляемую фракцию гексаном порциями по 50 мл, Затем гексановыйэкстракт отмывают до нейтральнойреакции по универсальной индикатор -ной бумажке, высушивают безводнымсульфатом натрия и выпаривают в токеазота на роторном испарителе, Далее сухой остаток растворяют в 0,2 млхлороформа и количественно переносятна стартовую линию хроматографической пластинки в виде полосы длиною80 мм, Рядом наносят свидетельпримерно 0,5-1 мкг Ы - токоферала,Хроматографическое разделениетокоферолов на подготовленных пластинках осуществляют в камере, насыщенной парами хлороформа, через которую в течение 15 мин продувают азот.Когда фронт растворителя приблизится к верхнему краю пластинки, необходимо извлечь ее из камеры и высушить в токе азота при 35-40 С,оЗатем обильно опрыскивают пластинку0,57-ным раствором железоаммонийныхквасцов в этаноле, высушивают в токетеплого воздуха и опрыскивают 0,5 Еным раствором батофенантролина вэтаноле.Обработанную пластинку выдерживают в горизонтальном положении 35 мин. При этом образуется розовокрасное пятно витамина Е на беломбесцветном:фоне пластинки, Затем подсушивают пластинку при 20-25 С, определяют локализацию Ы -токоферолапо свидетелю и количественно переносят окрашенный участок адсорбента впробирку с притертой пробкой,Затем в пробирку приливают 3 млэлюирующей смеси, состоящей из метанола, фосфорной и серной кислот вобъемном соотношении 93,8:6;0,2,энергично встряхивают 1 5-20 си фильтруют через обеззаленный фильтр (красная лента)., Сполоснув пробирку 1 млэтой же смеси, переносят ее на тотже фильтр, Полученный розовый фильтрат фотометрируют при 492 нм па сравнению с элюирующей смесью, Содержание витамина Е рассчитывают по калибровочному графику, построенномупо й -такоферолу,П р и м е р 2, Определение изомеров витамина Е в травяной муке излюцерны,Навеску травяной муки 0,05-0,1 гомыляют спиртовой щелочью и дальнейшие операции проводят так же, какописано в примере 1, По окончаниихроматографии проявляют пластинкитак же, как и при анализе желтка куриных яиц, Положение Ы -токаферолаопределяют по свидетелю, атокоферолав - пр величине К , Вседальнейшие процедуры такие же, каки при определении витамина Е в примере 1, При отсутствии специальных свидетелей допустимо определение концентрации изомеров витамина Е по калибровочному графику, построенному5по 1-токоферолу,П р и м е р 3. Определение сантохина в кормах,Навеску корма (1 г) заливают1030 мл хлороформа и взбалтывают нашюттель-аппарате в течение 15 мин,Затем фильтруют через. слой безводного сульфата натрия, Корм дважды промывают по 10 мл хлороформа и переносят на ту же воронку с сульфатомнатрия, Затем полученный экстрактупаривают на роторном испарителе до-.суха и растворяют в 1 мл хлороформа,На стартовую линию хроматографической пластинки наносят 0,05 мл полученного раствора в виде полосы длиной 60-80 мм, рядом наносят в видеточки свидетель - 0,01 мл растворасантохина в хлороформе (100 мкг/мл). 25ТСХ проводят в камере, насыщеннойпарами хлороформа. После того, какфронт растворителя поднимется попластинке доверху, ее извлекают Нзкамеры, подсушивают и далее обрабаты- З 0вают, как описано в примере 1, Сантохин проявляется в виде розово-красного пятна на белом фоне. Далее окрашенный участок силикагеля соскабливают и обрабатывают, как описано впримере 1, Содержание сантохина вкорме определяют по калибровочномуграфику,П р и м е р 4 Определение сантохина в премиксе, 40Осуществляют так же, как в примере 3, но после экстракции полученныйраствор не упаривают, а в мерной колбе доводят хлороформом до 100 мл,Из них 0,05 мл наносят на стартовую 45линию хроматографической пластинки иобрабатывают, как описано в примере 3,П р и м е р 5, Определение дилудина в корме,50Осуществляют так же, как в примере 3, но на хроматографическую плас, тинку наносят 0,1 мл полученного раствора, Хроматограмму проявляют, как и в пРимеРе 1, но Розово-кРасное пятно дилудина появляется на пластинке не сразу, а через 3-5 мин после опрыскивания хроматограммы раствором батофенантролина, Все последующие операции проводят аналогично примеру 3.П р и м е р.6, Определяют витаминЕ в желтке яиц, как описано в примере 1, но используют элюирующую смесьс различным соотношением фосфорнойкислоты, серной кислоты и метанола,Определение оптимального составаэлюирующей смеси при определении витамина Е и синтетических антиокислителей показано в табл,1,1Полученные данные позволяют заключить, что допустимым соотношениемкомпонентов в элюирующей смеси являютсяя:Фо сфо р на я кисло т а 5-7Серная кислота 0,1-0,3Метанол ОстальноеПри исполь зов анни р азр аб от аннойэлюирующей смеси достигается количественное элюирование цветного комплекса, образоваиного батофенантролином и железоаммонийными квасцамипод воздействием витамина Е илисинтетических антиокислителей, Прииспользовании цветной элюирующейсмеси цветной комплекс элюируется с .пластинки не полностью, Экспериментально также установлено, что использование в составе элюирующей смесидругих спиртов (этанол, бутанол, пропанол и др,), взамен метанола непозволяет полностью элюировать цветной комплекс, Кроме того, использование серной кислоты в количествахменьше 0,1 об. . также значительноснижает эффективность элюирующейсмеси, а увеличение ее количества вэлюенте более 0,3 об,% также нецелесообразно, так как значительно повышается кислотность среды и устойчивость окраски раствора снижается,Замена серной жислоты соляной илидругими минеральными кислотами такжеприводит к снижению эффективностиэлюирующей смеси.Орто-фосфорная кислота введенав состав элюирующей смеси в качествестабилизатора окраски. Оптимальнымее количеством в элюирующей смесиявляется 6 об, , Поскольку при уменьщении ее количества ниже 5 об. . илипри увеличении более 7 об.стабильность окраски элюата падает, то допустимыми пределами использованияфосфорной кислоты в элюирующей смесиявляется 5-7 об. .,332223 П .р и м е р 7. Определяют витамин Е и синтетические антиокислителив корме предлагаемым способом, Аналогично проводят анализ этого же5образца известным способом, С этойцелью отбирают 1 кг измельченной пшеницы, в которую вводят по 1 О мгв-токоферил-ацетата, сантохина, дилудина, бутилоксианизола (БОА) и бутилокситолуола (БОТ), При этом витаминЕ и синтетические окислители сначаларастворяют в 100 мл хлороформа ипульверизатором распыляют на измельченную пшеницу, одновременно перемешивая ее, Затем увлажненную хлороформом пшеницу просушивают в вытяжномшкафу до полного удаления запаха хлороформа, После этого отбирают по 1 гизмельченной пшеницы для определения 2 Овитамина Е и для определения синтетических антиокислителей,Определение витамина Е проводятаналогично примеру 1, Синтетическиеантиокиспители определяют аналогично 25примеру 3, При этом рядом с полоскойэкстракта на пластинку наносят в видеточек метчики - по 1 мкг сантохина,дилудина, БОТ и БОА, После окончанияхроматографии цветную реакцию на ЗОпластинке проводят аналогично примеру 1. На пластинке сначала появляются розово-красные пятна сантохинаи БОА, через 3-5 мин полностью прояв -ляется дилудин а еще через 5-7 мин -9 35розово-красное пятно БОТ, Все дальнейшие операции проводят, как описано в примере 1,а содержание о(-токоферола и синтетических антиокислителей определяют по калибровочным - 40графикам, Сравнительная характеристика предлагаемого и известного способов при определении витамина Е исинтетических антиокислителей в кормах представлена в табл,2,Таким образом, при сравнении обоих способов выявлено, что предлагаемый способ определения витаминовгруппы Е значительно превосходит известный как па чувствительности, таки по точности определений, При этомпредлагаемый способ дает возможностьколичественного определения сантовенно. хина, дилудина и синтетических антиокислителей фенольного ряда (БОА иБОТ) с высокой точностью и хорошей во спро из водимо стью ре з ультато в,Возможность селективного определения токоферолов и синтетических антиокислителей позволяет использовать предлагаемый способ как для анализа органов и тканей животных, таки для определения синтетических антиокислителей в кормах и пищевых продуктах,При проявлении пластинок путем ихобработки раствором железоаммонийныхквасцов, высушивания и обработкираствором батофенантролина чувствительность способа повышается в 2 раза, При этом, за счет того, что фонпрактически всегда остается бесцветным, повышается точность определений,При замене железоаммонийных квасцовна другие соли трехвалентного железа,например на хлорид железа, послеопрыскивания пластинка становитсяжелтовато-красного цвета, Это объясняется присутствием в солях трехвалентного железа следовых количеств Ге , особенно в старых реактивах после их хранения, На этом фоне железоаммонийные квасцы являются солью, где практически отсуствуют ионы Ре , что дает возможность использовать эту соль в смеси с батофенантролином в качестве цветореагента при определении витамина Е и синтетических антиокислителей,/Использование элюирующей смеси,полученной известным способом, дпяэлюирования цветного комплекса Ре+с батофенантролином невозможно, таккак окраска извлекается не полностью,а на 50-60%, Предлагаемый элюент из-влекает цветной комплекс количестформула изобретения Способ определения Ы -токоферола, предусматривающий омыление анализируемой пробы в присутствии пирогаллола при 90-95 С, экстракцию эфиром неомыляемой части пробы, высушивание эфирного экстракта, выпаривание и растворение полученного остатка в хлороформе с последующим тонкослойным хроматографическим разделением полученного раствора путем нанесения его на хроматографичсскую пластинку, элюирование адсорбированного слоя.смесью, содержащей спирт и неорганическую кислоту, проявление пластинок обработкой их цветореагентом и фотометрирование элюента, о т л и ч а ю -3 8в качестве неорганической кислотыфосфорную кислоту и серную кислоту,а в качестве спирта - метанол приследующем соотношении компонентов,об,7: 133222 щ и й с я тем, что, с целью повышения чувствительности способа, проявление пластинок ведут путем обработки их сначала раствором железо 5 аммонийных квасцов в этаноле с последующим высушиванием, затем раствором батофенантролина в этаноле, а элюирование окрашенного адсорбированного слоя осуществляют смесью, содержащей 10 5-7 0,1-0,3 ОстальноеФосфорная кислотаСерная кислотаМетанол Таблица Содернвние компонентов в алвирующея смеси Компонент 5 6 фосфорная кислота 0 Серная кислота 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0 2 99,8 98,8 97,8 96,8 95,8 94,8 93,8 92,8 92,8 90,8 89,8 Метанол Определено -токоферолв 1 Х 60,0 99 р 5 91 1 95 О 93 2 80,0 86,4 92 0 96,1 99,8 100 фосФорная кислота 6 6 6 6 1 Ое 5 020 Ое 25 Оэ 30 Ое 35 040 Ое 45 Ое 50 0,05 0,1 Серная кислота 0 9 Э,95 93,90 93,85 93,80 93 е 15 93,70 93,65 9 Э,60 93 т 55 93,5097, 2 99, 1 99, 8 100 99, 9 99, 8 98,0 96,9 95, 1 94,0 94,0 Метанол Определено с 1-токоферолв, 2 84,6 Величина Кв хлороформе Найдено, 3 Добавлено, мкг Количество 1 -токоферола в 1 г корма+ ПредлагаеЯ 1 й способ 10 98,4 0,5 10 97,6 0,2 сантохина 96,9 3Ш 10 днлудина 98,8 10 БОА 97,3 4В Известный способ 10 16 у 15 1 0,14 Ы-токоферилацетата 10 96,0 2 60 0,63 40 . 0,42 100 0,19 10 83,1 5 сант охина дилудина 10 54,0 20 10 58 рО 15 10 41 т 3 30 БОА 40 0,2880 0,52 БОТ 14 - количество определений равно 6,18,24 1 0,06 б"токофернл- ацетата 60 0,64 40 0,43 60 О,8 50 Ор 29 .60 Ов 52