Способ выделения нативных фракций из одноклеточных микроорганизмов

,5 и темпера дезинтеграци зинтеграторе 0 МПа, затем енную суспен листическом сси- авле в деком рабочи предварит ию обраба езинтегра лько ываре. ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ ОПИСАНИЕН АВТОРСКОМУ СВИДЕ(7 1) Устреди про выналазы а объевыЧСАВ (СБ) и Всесоюзный научно-исследовательский институт синтеза белковых веществ (БП).(72) Владимир Шилингер, Зденек Фенцлфрантишек Махек (СБ), А.Н.Григорян,А.П.Ковалев,В.В.Лалов и Т,А,Лущик (БП(54) СПОСОБ ВЬЩЕЛЕНИЯ НАТИВНЫХ ФРАКЦИЙ ИЗ ОДНОКЛЕТОЧНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ(57) 1. Способ выделения нативныхфракций из одноклеточных микроорганизмов путем механической дезинтеграции, о т л и ч а ю щ и й с я тем,что суспензию клеток микроорганизмовс концентрацией 1-.20 мас.Ж при 2. Способ по п.1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что суспензию клеток микроорганизмов подвергают дезинтеграции в декомпрессионном дезинтеграторе 2-6 раз. 43. Способ по п.1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что одноклеточными микроорганизмами являются дрожжи вида БасЬагошусея сегеч 1 я 1 ае, СапйЫа Тогц 1 оря 1 я, КЬодогогц 1 а, ОЫдиш,. Р 1 сМа, Напяепц 1 а.4. Способ по п.1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что одноклеточными микроорганизмами являются бактерии вида Ме 8 агегдиш, МегЬапошопая, ЕясЬегдсЬ 1 а со 11, грибки и водоросли.Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к способам выделения нативныхфракций из одноклеточных микроорганизмов методом механической дезинтеграции с целью изоляции отдельных фракций или их смесей, и может быть использовано при приготовлении концент-.ратов пищевого протеинаИзвестен способ выделения нативныхфракций из одноклеточных микроорганизмов путем баллистической дезинтеграции (авт.св. Ф 810808,С 12 М 1/00,1978).При применении баллистическихдезинтеграторов можно в промышленном масштабе при непрерывной технологии достичь любой необходимой степени разрушения клеток при соответ 20ствующем продолжении времени переработки материала.Недостатками этого способа являются локальный перегрев обрабатываемого вещества, что приводит к необхо-,димости интенсивного охлаждения,повторное разрушение уже полученныхклеточных фрагментов с образованием чрезвычайно мелких частиц (отединиц до сотых долей микрона),что значительно усложняет дальнейшее разделение твердой и жидкойфаз, Все это вместе взятое, т.е.увеличение расхода воды для охлаждения, электроэнергии, более длительное время обработки биомассы,удорожает процесс дезинтеграции иповышает конечную стоимость продукта.Наиболе близким по технической щ сущности и достигаемому эффекту к предлагаемому является способ выделения нативных фракций из одноклеточных микроорганизмов путем механической дезинтеграции с использованием 45 эффекта декомпрессии авт.св.9602651, кл. С 12 М 1/04, 1975). Суспензия микроорганизмов насыщается газом под давлением (азотом, воздухом, углекислым газом), который не должен реагировать с внутриклеточными компонентами и также не должен ингибировать энзимы, особенно эндофенные ядра, используемые для деградации нуклеиновых кислот в микробиальном белке. При этом газом насыщаются и клетки до выравнивания парциального давления с обеих сторон клеточной оболочки, после чего суспензия резко переводится в зону атмосферного давления. Результатом является градиент давления газа в клетке, направленный во внешнюю среду, Поскольку скорость выхода газа из клетки выше скорости диффузии через клеточную оболочку происходит разрыв последней.Дезинтеграция способом быстрой декомпрессии осуществляется в устройстве, состоящем из компрессора газа, насоса-дозатора высокого давления для суспензии микроорганизмов и двух цилиндров высокого давления для насыщения и перевода суспензии. Преимущество декомпрессионной дезинтеграции заключается в том, что клетки или же клеточные оболочки последезинтеграции остаются целыми или незначительно размельченными и, следовательно, их можно легко отделить от протоплазмы при помощи сепарации,Описанный способ не приводит кинактивации внутриклеточных энзимов и позволяет выделять химические компоненты клеток в нативном состоянии. Энергетические затраты при декомпрессионной дезинтеграции низкие и составляют 0,06 квт ч/кг, тогда как при экструзионном или баллистическом разрушении клеток расходуется 0,2-0,4 кВт/ч/кг.Однако процесс декомпрессионной дезинтеграции не обеспечивает достаточно, высокой степени выхода внутри- клеточных химических компонентов вовнешнюю среду, а также на него оказывает значительное влияние рН перерабатываемой суспензии, поэтому необходимо процесс дополнить экстракцией . биомассы разрушенных клеток.Это проиллюстрировано в таблице, где показана величина рН суспензии дрожжей БасЬагошусев сегеч 1 зхае в зависимости от степени извлечения водорастворимого белка во внутриклеточную среду (супернант) из клеток,разрушенных декомпрессионным способом. Для сравнения приведены значениядля одно- и шестикратной дезинтегра-.ции.Количество водорастворимого белка в неразрушенной клетке составляет 203 от общего содержания протеина (Нх 6,25).Как видно из таблицы, практически все количество водорастворимого белка освобождается из дезинтегриро 1291603ванных клеток только при рН 9,0. Степень извлечения белка при рН 11, превышающую 1007, можно объяснить ,дополнительным растворением щелоче- растворимых фракций протеина. Разрушающее действие декомпрессии на оболочку клетки длится сотые доли секунды. После этого клетка уже не подвергается механическому напряжению и из нее вытекает только часть 10 протоплазмы, содержащей протеин. При повторном декомпрессионном воздействии, в межклеточное пространство переходит еще некоторая часть белка, количество которого зависит от 15 рН внешней среды и количества дезинтеграции. Нарушений оболочки клетки, однако, уже больше не происходит. Таким образом, существует пропорциональная зависимость между количест вом выделяющегося из клетки белка и числом операций дезинтеграции, а также значением рН суспензии.Недостатком известного способа 25 является низкий выход белка во время дезинтеграции суспензии при рН около 7,0, необходимы также более высокие значения рН для более полного освобождения или даже выделения белка из 30 разрушенных клеток, степень выхода внутриклеточных нуклеаз более низкая, чем при дезинтеграции баллистическими дезинтеграторами.Целью изобретения является выде ление внутриклеточных химических компонентов в нативном состоянии из биомассы микроорганизмов на более короткое время и при более низких энергетических затратах с высоким 40 выходом и получением суспензии, содержащей довольно крупные клеточные ферменты, отделение которых на стандартных сепараторах не представляет трудности, 45Поставленная цель достигается тем, что согласно способу выделения нативных фракций из одноклеточных микроорганизмов путем механической 50 дезинтеграции суспенэию клеток микроорганизмов с концентрацией 1-20 мас.Е при рН 4,5-9,5 и температуре 0,70 С сначала подвергают дезинтеграции в декомпрессионном дезинтеграторе с рабочим давлением 3-30 МПа, после чего предварительно раздробленную суспензию обрабатывают в баллистическом деэинтеграторе. При этом суспенэию клеток микроорганизмов подвергают дезинтеграции в декомпрессионном деэинтеграторе 2-6 раз, а одноклеточными микроорганизмами являются дрожжи вида БасЬагошусея сегечдя 1 ае, Сапй 1 оа, Тоги 1 орядя, КЬодошоги 1 а, 01 д 1 шп, Ргсй 1 а, Напяепи 1 а, бактерии вида Медагег 1- цш, Мегйапошопая, ЕясЬег 1 сЬа со 11 грибы и водоросли. Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.Выделение нативных фракций из одноклеточных микроорганизмов производят из их водной суспенэии с концентрацией клеток 1-20 мас.7, при 0-70 С6 и рН 4,5-9,5. Суспензию один или несколько раз обрабатывают в периодическом или непрерывном деэинтеграторе. В качестве рабочего газа применяют воздух, азот или любой другой газ, химически инертный по отношению к клеткам. Суспенэию насыщают сжатым воздухом под давлением 3-30 МПа, выдерживают под давлением 15-60 с и переводят в область барометрического давления. При этом происходит декомпрессионная дезинтеграция клеток микроорганизмов.Далее суспенэию обрабатывают в баллистическом дезинтеграторе, содержащем мелющие тела с диаметром 0,4- 0,5 мм, преимущественно при соотношении насыпного объема сухих мелющих тел к объему суспензии клеток 1,7:1. При этом эа 5-10 мин дезинтеграции в раствор переходит 80-957 водорастворимых клеточных фракций в нативном состоянии, которые выделяются и очищаются известными методами.П р и м е р 1. Водную суспензию дрожжей Басйагошусея сегеч 1 я 1 ае с концентрацией клеток 9,8 мас.7, имеющую температуру 20 С и рН 8,4, однократно обрабатывают в лабораторном декомпрессионном дезинтеграторе периодического действия, состоящем из цилиндрической камеры - преобразователя высокого давления рабочей емкостью 35 мл, снабженной запорным клапаном, циклона-расширителя и приемного сосуда. Суспензию помещают в камеру, насыщают сжатым азотом под избыточным давлением 9-10 МПа и после 25-секундного насыщения газом выстреливают через эапорный клапан в циклон-расширитель. Дезинтегриро-ванную суспенэию собирают в прием29 603 45 Степень извлечения водорастворимого белка, 7 рН Шестикратнаядезинтеграция Однократнаядезинтеграция 51,0 8,0 4,5 68,3 12,0 7,0 96,5 18, 1 9,0 11,0 124,0 24,9 ный сосуд и перерабатывают на однодисковом баллистическом вертикальномдезинтеграторе со скоростью вращениядиска 180 м/с и стеклянными шарикамидиаметром 0,4-0,56 мм, отношение5объема суспензии к насыпному объемусухих шариков в деэинтеграторе 1; 1,7.Эффективность дезинтеграции оцениваютпо выходу растворимого в воде белка в межклеточную среду. 1 ОДля сравнения проводят опыт,в котором биомассу обрабатывают только в баллистическом дезинтеграторе.Кривые на чертеже изображают результаты дезинтеграции на баллистическом 5дезинтеграторе в сравнении с предлагаемым способом в зависимости от времени, где кривая 1 - ход комбинированного дробления предлагаемым способом с одним предварительным дроблением, кривая 2 - то же, с двумя предварительными дроблениями, кривая 3то же, беэ предварительного дробления.Как видно из чертежа в опыте спредварительной декомпрессионнойдезинтеграцией практически весь водорастворимый белок переходит в раствор в течение 5 мин баллистическойдезинтеграции; при баллистической 30дезинтеграции без предварительной декомпрессионной обработки для перехода в раствор того же количества водорастворимого белка требуется 24 мин.Таким образом, предварительная декомпрессионная дезинтеграция позволяет сократить время баллистическойдезинтеграции на 21 Ж,П р и м е р 2. Опыт проводят натой же суспензии и в тех же условиях, что и в примере 1, но предварительную декомпрессионную дезинтеграцию проводят двукратно. Временнойход опыта и выход представлены кривой 2 на чертеже 1. П р и м е р 3. Водную суспензию дрожжей ЯасЬагошусез сегепздае с концентрацией клеток 15 мас.7, имеющую температуру 50 фС и рН 7,5, однократно обрабатывают в декомпрессионном деэинтеграторе при давлении 19- 20 МПа. Остальные условия такие же, как в примере 1. Выход белка за тот же период времени 167 к абсолютно сухому весу дрожжей (как в примере 1) .П р и м е р 4. Вместо суспензии дрожжей ЯасЬагопасез сегечдздае дезинтеграции подвергают суспензию бактерий МесЬапошопаз. Условия дезинтеграции такие же, как в примере 1. Выход белка эа тот же период времени 193 к абсолютному сухому весу бактерий.Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет сократить время обработки клеток в баллистическом дезинтеграторе в 4-5 раз, если суспензия предварительно подвергалась декомпрессионной дезинтеграции. При этом значительно снижается степень нагрева суспензии, что приводит к повышению производительности баллистического деэиатегратора, экономии охлаждающей воды и энергии.В случае выделения каких-либо термонеустойчивых фракций клеточного содержимого повышается их выход и сохраняется активность. Применение предлагаемого способа позволяет выделять клеточные энзимы в активном состоянии, например внутриклеточную нуклеазу и испольэовать ее далее для разрушения нуклеиновых кислот, содержащихся в клетках микроорганизмов.Признано изобретением по результатам экспертизы, осуществленной Ведомством по изобретательству Чехословацкой Социалистической Геспублики.1291 б 03 па жид эо оставитель В.Гли ехред М.Ходанич ррек утяга актор Н.Егорова Заказ 20 свое к т а оизводственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул, Проектная,Тираж 500 ВНИИПИ Государственног по делам изобретений и 113035, Москва, Ж,митета ССС ытий кая наб.,