Способ индикации сообщества поч-венных микроорганизмов

п 11 815034 Сфез Советских Сфв 1 наектнчесвнх РесеубанкОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИ ВПЛЬСТВУ(51)М 1(д.3 с присоединением заявки Й 9 -С 12 К 1/04 Госуяеустаеявый коннтет СССР ве агав язебрвтеяяй в. втврытяй(72) Авторыизобретения В,С.Гуэев, Н.Г.Бондаренко, Б.А.Бызов, Т.Г.Мирчинки Д.Г.Звягинцевг-с э1 фсМосковский ордена Ленина и ордена Тру одого Красного:" ГЗнамени государственный университет им.;М.В.Ломоносова(54). СПОСОБ ИНДИКАЦИИ СООБЩЕСТВА ПОЧВЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВПостачто обранием покбируют вратуры ишие на иганиэмыронной ми Изобретение относится к микробио-. логии, а именно микробиологическому анализу почвы при воздействии на нее различными антропогенными факторами.Известен способ индикации сообщества почвенных микроорганизмов пу-. тем инкубирования образцов почвы с последующим микробиологическим изучением микроорганизмов. По данному .способу в почву закладывают предметные стекла и оставляют на определенный срок. Поверхность стекол обрастает микроорганизмами,и их микроскопируют в световом микроскопе. Данный способ позволяет определитьобщее количество и биомассу микроорганизмов в почве 11 .Однако известный способ недостаточно чувствителен, так как не дает информации о микробном сообществе в целом, его структуре, соотношении отдельных групп микроорганизмов,взаимоотношении и взаимодействии между отдельными популяциями микроорганизмов в сообществе, об истинном доминировании тех или иных микроорганизмовЦель изобретения - повышение чув- ствительности способа. вленная цель достигается тем, зцы почвы перед инкубироварывают слоем крахмала, инку- условиях постоянной темпе- влажности и исследуют выросоверхности крахмала микроорс помощью сканирующей злекткроскопии. 10П р и м е рИсследуемую почву ввоздушно-сухом состоянии растираютв ступке, предварительно удалив крупные корешки, просеивают через ситов 1 мм, увлажняют дистиллированной 15 водой до 60 от полной влагоемкости,добавляют, если нужно, изучаемыйагент вместе с водой и тщательно перемешивают. Пастообраэную массу вносят в чашки Петри диаметром 4 см и 20 слегка уплотняют шпателем так, чтобыобразовалась ровная горизонтальнаяповерхность. Чашки с почвой помещают в обычно используемые в микробиологии чашки Петри диаметром 10 см.25 Иа дно большой чашки Петри наливаютдистиллированную воду для поддержания постоянной влажности. В такомсостоянии чашки выдерживают в термостате при температуре 25 С в течение.30 всего опыта.Так как микроорганизмы в почве находятся в рассеянном состоянии, то их инициируют субстратом. Испытание большого числа различных органических субстратов показывает, что наибо. лее удобным является картофельный водорастворимый крахмал. Так как не существует специфической микрофлоры, разрушающей крахмал, его может ис-пользовать самый широкий набор почвенных микроорганизмов, что видно иэ практики использования в микробиологии крахмало-аммиачного агара. Кроме того, крахмал нельзя считать чужеродным материалом для почвы, он является основным запасным полисахаридом растений, Особенно велика роль крахмала в почвах агроцеиозов.Крахмал наносят через неделю после выдерживания увлажненной почвы в термостате. Наносят на поверхность почвы полоской, шириной около 1 см по диаметру чашки. Производится это следующим образом.На тонкий слой крахмала осторожно накладывают два чистых листа бумаги,20 чтобы щель между ними была равна 1 см,5 чашку с почвой. переворачивают и аккуратно по диаметру чашки прикладывают на 1 с к образовавшейся полоске. Затем быстро сдувают лишнее количество крахмала сжатым воздухом, так что- З 0 бы на почве осталась тонкая полоска не более 2-3 слоев крахмальных Мерен. При таком способе нанесения концентрация крахмала составляет около0,05 от веса почвы.За развитием микроорганизмов на полоске крахмала проводят регулярное наблюдение (визуальное), документируя макросьемкой в масштабе 1:1 на цветную обратимую фотопленку. В дальнейшем зти фотогра" фии позволяют воссоздать последова тельность раэвития микробного сообщества. Наблюдение за развитием мик" робного сообщества проводят с помощью светового микроскопа в отраженном свете при увеличениях от 5 до 50 45 крат, фотографируя отдельные участки.Для детального наблюдения за амилолитическим микробным сообществом используют сканирующий электронный микроскоп. Техника взятия образцов яп сводится к следующему. Из почвы вы" резают цилиндрический монолит площадью 0,5 см с тем объектом на поверхности, который необходимо микро- скопировать. Монолит наклеивают электропроводящим клеем на объектный столик микроскопа. Образцы Фиксируют в парах четырехокиси осмия в течение суток над 2-ным раствором. Для обезвоживания образцов в большинстве случаев применяют воздушную сушку при 60 комнатной температуре в течение суток. В случае, если микробные клетки сильно деформировались при воздушной сушке, применяют лиофильное высушивание иэ замороженного состояния, 65 Для этого почвенный монолит помещают в жидкий фреон и высушивают при постоянном охлаждении в вакуумном универсальном посте. При микроскопировании чистых культур отдельных микроорганизмов проводят их фиксацию 2,5- ным раствором глютаральдегида в фосФатном буфере (рН=7,2) при 4 .С в течение часа. Затем образцы промывают буфером 30 мин при 4 С. Обезвоживание производят в серии растворов зтанола при 20 ф 50-ный раствор спирта 30 мин, 70-ный 30 мин, 90-ный 1 час, 90-ный 12 ч, 95-ный 30 мин, 95- ный 30 мин, 100-ный трижды сменяют спирт через 30 мин. Далее замещают спирт на амилацетат. Высушивание образцов проводят по критической точке, замещая амилацетат жидкой углекислотой на установке НСР. Напыление об раэцов углеродом и золотом проводят в вакуумном испарителе. Толщина напыляемого слоя приблизительно 100 Й, Просмотр препаратов проводят в сканирующем электронном микроскопе.Под контролем наблюдения в световом микроскопе проводят выделение отдельных микроорганизмов с полоски крахмала на твердые питательные среды с помощью препаровальной иглы. Для выделения микромицетов используют агаризованную среду Чапека, для бактерий и актиномицетов - крахмалоаммиачный агар, для дрожжей - сусло- агар. В большинстве случаев удается выделять организмы сразу в чистые культуры, так как подавляющая часть микроорганизмов развивается достаточно обособленно.Для сбора почвенных беспозвоночных применяют традиционный метод воронки. Через фильтр из мельничного. газа нематоды выгоняют водой, а клещи " светом и фиксируют спиртом.С помощью данного способа оценено микробиологическое состояние 2-ух типов почв при воздействии ряда антропогенных факторов. В дерново-подзолистой почве - влияние различных доз аммиачной Формы азотных удобрений - сульфата аммония, в черноземе - .загрязнение почвы различными концентрациями соли свинца (свинцом аэотнокислым).Предлагаемый способ позволяет выявить различные группы микроорганиэмовчленов инициированного микробного сообщества различных почв. Прокариотные микроорганизмы- бактерии можно встретить в инициированном микробном сообществе, как правило, на поздних стадиях развития, через несколько месяцев. Бактерии часто развиваются на отмерших грибных гифах. Кроме бактерий, хорощо колониэирующих субстрат, можно встретить стебельковые бактерии в рассеянном состоянии. Видовая идентификация бактерий очень сложна и трудоемка. Выявляемые с помощью сканирующего электронного микроскопа морфологические особенности отдельных бактерий позволяют проводить их предварительную групповую идентификацию, Так как эти организмы не являются доминантами в инициированном микробном сообществе, предварительноц:о разделения на группы часто вполне достаточно.Актиномицеты также являются членами амилолитического микробного сообщества, особенно на ранних стадиях его развития. Этн микроорганизьы морфологически характеризуются хорошо развитым и однородным.по толщине мицелием и ярко выраженными спиральными Спороносцамн, состоящими из отдельных спор. Эти организмы часто развивается отдельными микроколониями и легкО Могут быть вычленены в чистую культуру. Предварительная идентификация возможна .и без выделения в чистую культуру.Основными деструкторами крахмала являются микроскопические грибы.Степень покрытия крахмала микромице. тами чаще всего приближается к 100, и они всегда выделяются как доминан- " ты.инициированного микробного .сообщества. Иногие из них не всегда удается выделить на питательные среды, и тогдаданные электронно - микроскопического анализа, выявляющие большое количество морфологических осо.- бенностей данной группы микроорганизмов, являются единственным источником инФормации для их идентификации. Представители рода Реп 1 с 1111 цв хорошо выявляются благодаря своему характерному строению конидиального аппарата. Плодовые тела сумчатых грибов рода Спаевоеце имеют на своей поверхности характерные выросты,что облегчает их предварительную идентиФикацию. Для выделения сумчатых гри. бов в чистую культуру необходимо использовать специфические среды, содержащие клетчатку. Пнкнидиальные несовершенные грибы трудно выделить в чистую культуру, и их идентификация может быть осуществлена на основе мор фологическнх особенностей, выявляеиюх с помощью электронного микроскопа.Дрожжевые организьы также могут быть членами инициированного Микробного общества, причем они могут занимать значительные пространства и являться доминантами микробного сообщества на более поздних стадиях его развития. В морфологическом отношении дрожжи являются более однородной группой, но по своим размерам они могут сильно варьировать. И даже в. этой группе микроорганизмов сканируюший электронный микроскоп выявляет много морфологических особенностей, к сожалению, недостаточных для их идентификации. В то же время по микрофотографиям можно судить о состоянии дрожжей в данном сообществе .На более поздних стадиях развития (через несколько месяцев) инициированного микробного сообщества, когда частично уже прошла минерализациякрахмала, можно встретить и автотрофные микроорганизваю, т.е. диатомовыеводоросли класса Сепйг 1 сае и классаРеппайае. Особенно много водорослейпроявляется при проведении их на свету. Выявляемые на.микрофотографияхморфологические особенности дают ценную информацию для идентификации этих организьюв.Следующей группой в инициировант.ном микробном сообществе являютсяконсументы второго порядка-организ:мы,поедающие первичных потребителей крахмала.Е этой группе можно отнести разнообразных представителей прос 20 тейших и микроскопических беспозвоночных животных. Видовое разнообразиеэтой группы обычно невелико.Наблюдения свидетельствуют,что раковинные амебы отряда Те 5 сас 1 да и рода Сепсгррух 1 в питаются главным образом дрожжами и встречаются только при интенсивном развитии последних. Нематоды нз группы микроскопических коль чатых червей отряда Ту 1 епсй 1 дае и микроартроподовые клещи семейства Асаг 1 дае одинаково хороша питаются как дрожжевыми клетками,так и микроскопическими грибами н актиномнцетами,Причем нематоды избирательно поедают только грибной мицелий,в то вре.мя как клещи могут питаться как мицелием грибов,актиномицетов,так и их спорами. Идентификация этой группы проводится на основе морфологнческих особенностей, выявляемых с помощью 40 светового .и электронного микроскопов. Эти микроорганизмы завершают пирамиду структуры микробного амнлолитического сообщества и встречаются в нем на более поздних этапах, обычно после месяца ннкубации.Предлагаемый способ позволяет с болььюй степенью достоверности определить всех представителей инициированного микробного сообщества (бактерий, актиномицетов, грибов, водорослей, простейших, микроскопических беспозвоночных), что нельзя сделать ни одним из известных способов, Способ позволяет изучить не только структуру, ио и особенности инициированного микробиого сообщества, т.е. ис,тинное доминирование, соотнсвениеотдельных групп микроорганизмов, взаимодействие и взаимоотношения междуотдельными популяциями микроорганизр мов в сообществе, биологические осо;бенности доминирующих организьюв,скорость и характер роста отдельных:популяций. микроорганизмов в сообществе и их сукцессию. Совокупность этиху показателей служит критерием для объ615034Составитель С. ИМееинРедактор Т,Киселева Техред Н. Еавтура, Корректор ю. иакаренкоЭЗаказ, 962/41 Тирах 521, Йоддисноевниипи ГосударатвеаиоМ кемитета сссупо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Уауввркаа иаб., д. 4/5 филиал ППП "Патентф, г. Ухгород, ул. Проектная, 4 ективной и интегральной оценки влиянии различных антропогенных загряз- нений на истинное микробиологическое состояние почвы.формула изобретенияСпособ индикации сообщества поч венных .микроорганизмов путем инхуби рования образцов почвы с Посладуиврвм микробиологическим исследованием микроорганизмов, о т л и .ч а в щ и й. с я тем, что, с целью новыыении чув ствительности способа, образцы ноч вы перед инкубированием покрываютслоем крахмала, инкубируют в условиях ностоинной температуры и влаиност и исследуют вмросвие на поверхности крахмала ивкроорганизмы с помощьюскаиируювавй электронной микроскопии,Источники информации,праиитме во внимание при экспертизе1. Ъабьева И.П., Агре Н.С, Прак,тическое руководство по биологиий почв. И., Изд во ИГУ, 1971, с. 22-,23.